GB/T 21854-2025 化学品 鱼类早期生活阶段毒性试验

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21854—2025代替 GB/T21854—2008

　　化学品 鱼类早期生活阶段毒性试验

　　Chemicals—Fish early-lifestagetoxicitytest

　　2025-08-29发布 2025-12-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21854—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 受试物信息 2

　　5 试验原理 2

　　6 仪器设备 2

　　7 试验准备 3

　　8 试验程序 3

　　9 质量保证与质量控制 5

　　10 数据与报告 6

　　附录 A (资料性) 推荐鱼种的试验条件 、周期和存活率 8

　　附录 B (资料性) 推荐试验鱼种的喂养 、繁殖操作要求 9

　　附录 C (资料性) 合格稀释水的化学特性 10

　　附录 D (资料性) 基于不同终点的 NOEC测定的统计 11

　　附录 E (资料性) 回归估计的统计 14

　　参考文献 16

　　Ⅰ

　　GB/T 21854—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 21854—2008《化学品 鱼类早期生活阶段毒性试验》,与 GB/T 21854—2008相

　　比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　— 增加了 “鱼叉长”“鱼标准长”“鱼全长 ”“效应浓度 ”“不明复杂物质 ”术语和定义(见 3. 1~ 3. 4、 3. 7) ;

　　— 更改了受试物信息内容(见第 4章 ,2008年版的第 3 章) ;

　　— 更改了试验原理(见第 5 章 ,2008年版的 4. 1) ;

　　— 更改了仪器设备(见第 6章 ,2008年版的第 5 章) ;

　　— 更改了试验准备和试验程序(见第 7章和第 8章 ,2008年版的第 6章和第 7章) ;

　　— 更改了质量保证与质量控制(见第 9章 ,2008年版的第 8章) ;

　　— 更改了数据与报告(见第 10章 ,2008年版的第 9章) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 :生态 环 境 部 固 体 废 物 与 化 学 品 管 理 技 术 中 心 、辽 宁 省 生 态 环 境 事 务 服 务 中 心 、生态环境部南京环境科学研究所 、上海市检测中心 、北京师范大学 、上海环境科学研究院 、广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 。

　　本文件主要起草人 :刘晓建 、刘洪英 、滕晓明 、白杨 、王蕾 、马燕 、杨力 、杨琨 、董梦琦 、李文超 、杨力 、李非凡 、陈晓倩 、刘济宁 、胡双庆 、陈桂兰 、杨希晨 、张洪昌 、胡俊杰 、卢玲 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2008年首次发布为 GB/T 21854—2008;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅲ

　　GB/T 21854—2025

　　化学品 鱼类早期生活阶段毒性试验

　　1 范围

　　本文件规定了化学品鱼类早期生活阶段毒性试验的受试物信息 、仪器设备 、试验系统 、试验程序 、质量保证与质量控制 、数据与报告的要求 。

　　本文件适用于测试化学品对早期生活阶段的鱼类致死和亚致死效应 , 以评价对鱼类的慢性毒性和亚慢性毒性效应 。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件 。

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　鱼叉长 fish fork length; FFL

　　用于难以分辨脊椎柱末端的鱼类体长测量的 ,从吻尖到中尾鳍线末端的直线距离 。

　　3.2

　　鱼标准长 fish standard length; FSL

　　从吻尖到尾鳍基部最后一节椎骨的末端或到尾鳍基部 ,不包括尾鳍长度的直线距离 。 3.3

　　鱼全长 fish totallength; FTL

　　从吻尖到尾鳍较长叶末端的直线距离 。

　　3.4

　　效应浓度 effectconcentration; ECx

　　在给定测试周期内 ,与对照组相比 ,导致 x%受试生物出现某观察效应的受试物浓度 。

　　[来源 : HJ 1257—2022,2. 1. 33] 3.5

　　最低可观察效应浓度 lowestobserved effectconcentration; LOEC

　　在给定测试周期内 ,与对照组相比 ,在统计学意义上对受试生物产生显著效应(p小于 0. 05)的最低受试物浓度 。

　　[来源 : HJ 1257—2022,2. 1. 38] 3.6

　　无可观察效应浓度 no observed effectconcentration; NOEC

　　在给定测试周期内 ,与 对 照 组 相 比 , 在 统 计 学 意 义 上 对 受 试 生 物 未 产 生 显 著 效 应(p大 于 或 等 于0. 05)的最高受试物浓度 。

　　[来源 : HJ 1257—2022,2. 1. 39]

　　1

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　　3.7

　　不明复杂物质 substanceofunknown orvariablecomposition, complexreaction productsorbiolog- icalmaterials; UVCB

　　组分未知或可变的物质 、复杂反应产物或生物材料 。

　　[来源 : HJ 1257—2022,2. 1. 3]

　　4 受试物信息

　　受试物所需信息应包括 :

　　a) 结构式 ;

　　b) 纯度 ;

　　c) 水中溶解度 ;

　　d) 蒸气压 ;

　　e) 水中解离常数(pKa) ;

　　f) 正辛醇/水分配系数(Pow ) ;

　　g) 在水中 、光中 、试验条件下的稳定性 ;

　　h) 相同鱼种的急性毒性试验结果 ;

　　i) 快速生物降解性试验结果 ;

　　j) 在试验溶液中受试物的可靠定量分析方法及其精确度 、检测限 ;

　　k) 受试物为混合物的 ,其成分信息 、含量和物质特性 。

　　5 试验原理

　　将处于早期生活阶段的鱼(或受精卵)暴露于含不同浓度受试物的系列试验溶液中 ,采用流水条件进行试验 ,若流水条件不可行 ,则采用可维持浓度稳定的半静态条件 ,该系列浓度需包含测试周期内可能引起致死和亚致死效应的浓度 。开始试验时 ,将受精卵放入试验容器中 ,至对照组中的鱼达到幼鱼阶段时结束试验 。通过观测致死和亚致死效应 , 以及与对照组的比较来确定受试物的最低可观察效应浓度(LOEC)和无可观察效应浓度(NOEC) ;或者通过计算得到效应浓度(ECx ,如 EC10、EC20) 。

　　6 仪器设备

　　仪器设备包括 :

　　a) 溶解氧测定仪 ;

　　b) 水硬度计 ;

　　c) pH 计 ;

　　d) 分析天平 ;

　　e) 总有机碳分析仪 ;

　　f) 温度控制仪 ;

　　g) 水质测定仪器 ;

　　h) 受试物分析仪器 ;

　　i) 样品前处理仪器设备 ;

　　j) 全玻璃 、不锈钢或其他化学惰性材质的试验容器 ;

　　k) 实验室常用玻璃器皿 ;

　　2

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　　l) 流水式系统(可选) 。

　　7 试验准备

　　7. 1 受试生物

　　推荐使用的受试生物为稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)和斑马鱼(Daniorerio)等 ,见表 1。推荐鱼种的试验条件 、周期和存活率见附录 A,喂养与繁殖操作要求见附录 B。使用其他鱼种时 ,试验条件应作相应调整 ,并在报告中说明鱼种选择理由和试验方法 。

　　表 1 推荐的受试鱼种

　　淡水鱼种

　　河口和海洋鱼种

　　稀有鮈鲫 Gobiocyprisrarus

　　杂色鳉 Cyprinodonvariegates

　　斑马鱼 Daniorerio

　　银汉鱼属 Menidiasp.

　　虹鳟鱼 Oncorhynchusmykiss

　　—

　　黑头软口鲦 Pimephalespromelas

　　—

　　青鳉 Oryziaslatipes

　　—

　　7.2 试验用水

　　试验用水应满足鱼类长期生存与正常生长的需要 ,整个试验期间水质应保持恒定 。定期取样分析 。若稀释水质量稳定 ,每隔半年测定重金属 、主要的阴离子和阳离子 、氨 、有机氯农药残留 、总有机碳以及悬浮物等指标 。如稀释水质量不稳定 ,则应增加测定频次 。合格稀释水的化学特性见附录 C。

　　7.3 试验溶液

　　试验溶液通过稀释受试物贮备液进行制备 。受试物贮备液宜优先采用机械方法(如搅拌或超声)进行制备 ,也可采用饱和柱法和被动加标法制备贮备液 。某些情况下 , 为配制适当浓度的贮备液 ,可使用助溶剂 。若使用助溶剂 ,应同时设置溶剂对照 ,溶剂对照组中溶剂水平应与所有处理组相同 。如果难以实现 ,溶剂对照组的溶剂水平应与受试物处理组的最高溶剂水平相等 。溶剂浓度宜尽可能低 ,不应高于100 μL/L。

　　8 试验程序

　　8. 1 准备

　　8. 1. 1 试验容器

　　用全玻璃 、不锈钢或其他化学惰性材质制成 ,其尺寸应符合承载率的要求 。 由于有机硅对亲脂性物质有较强的吸附能力 ,流水式试验中尽量减少使用有机硅耗材 。试验容器应在试验区域内随机摆放 ,避免不必要的干扰 。受试生物应在暴露浓度稳定后再加入 。

　　8. 1.2 受精卵、胚胎和仔鱼的处理

　　8. 1.2. 1 试验初始阶段 ,将受精卵 、胚胎轻轻移入置于大容器中的小试验容器中 ,小容器的侧壁或底部有足够大孔径的网孔 ,确保试验溶液能流经这些小容器 , 以及孵化后的仔鱼能够落进大容器 。若有必要

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　　让溶液在这些小容器中产生非湍流流动 ,将它们固定在悬臂上 ,通过悬臂能使小容器浮在溶液中并上下移动 ,但要始终保持受试生物浸没在溶液中 。

　　8. 1.2.2 仔鱼孵出后 ,根据不同种类的受试生物 ,需要将大容器内用于放置鱼卵的小容器(格栅或网)移除 。如果有必要将仔鱼移出 ,转移时仔鱼不应暴露于空气中 ,也不应用网具捞取 。转移仔鱼的时机因种类而异 ,是否转移应根据需要而定 。

　　8. 1.3 暴露条件

　　暴露条件如下 。

　　a) 暴露方式 :采用半静态试验时 ,将受精卵或仔鱼移入装有新配制试验溶液的试验容器中 ,或将受试生物留在试验容器内 ,按一定比例(更换量不少于 2/3) 更换试验溶液 。 流水式试验中 ,应具备受试物贮备液连续分配和稀释系统 。试验期间定期检查贮备液和稀释水的流量 ,保证变化应不大于 10% 。通常每 24h 的流量应不少于试验容器体积的 5 倍 。在满足本文件规定的承载率下 ,也可设定较低的溶液流速(如 2个 ~ 3个试验容器体积/24h) , 以防止投喂的饵料随溶液快速流失 。

　　b) 持续时间 :在鱼卵受精后尽快开始试验 。在囊胚开始卵裂之前 ,应将囊胚浸在试验溶液中 ,或尽可能地接近该阶段开始试验 ,至少持续到对照组幼鱼能自由摄食 。试验持续时间取决于所选鱼种(见附录 A) 。

　　c) 承载率 :试验 开 始 时 , 受 精 卵 的 数 量 应 满 足 统 计 分 析 的 需 要 。 受 精 卵 应 随 机 分 配 于 各 浓 度组 ,每个浓度组至少 80粒卵 ,平均分配到至少 4个平行组 。承载率不宜过高 , 以保证在没有充气的情况下 ,鱼卵和仔鱼阶段试验溶液的溶解氧饱和度不低于 60% 。 流水式试验中 ,24 h 承载率不超过 0. 5 g/L(以湿重算) ,且任何时刻容器内溶液的承载率不超过 5 g/L。

　　d) 光照和温度 :光周期和水温应适合受试生物(见附录 A) 。

　　e) 喂食 :为满足正常生长需要 ,对不同生长阶段的鱼适时适量投饵 。 除非根据死亡率进行调整喂食量 ,否则每个平行的喂食量应大致相等 。投饵应使鱼饱食 ,尽量保证残饵最少 。及时清除剩余食物和粪便 。 喂食方案见附录 B。

　　8. 1.4 试验浓度

　　8. 1.4. 1 根据急性毒性试验结果 96h LC50或预试验结果设定试验浓度范围 ,试验最高浓度不超过96h LC50值或 10mg/L(二者取较低值) 。通常以几何级数设置 5个受试物浓度 ,每个浓度至少 4个平行 ,浓度的间隔系数不大于 3. 2。如果仅仅为了获得 NOEC,可开展少于 5 个浓度的限度试验或扩展限度试验 ,但应说明浓度设置少于 5个的理由 。

　　8. 1.4.2 在试验系列中应设置一个试验用水对照组 ,如果试验中使用了助溶剂 ,应设置一个助溶剂对照组 ,助溶剂浓度应不高于 100 μL/L。

　　8.2 试验操作

　　8.2. 1 分析与测定频次

　　8.2. 1. 1 试验开始前 ,应建立试验溶液中受试物的分析方法 ,并进行方法验证 。

　　8.2. 1.2 试验期间 ,受试物浓度应定期测定至少 5 次 。流水式试验中 ,应至少每周对每个浓度的一个平行进行浓度测定 ,每次选择不同平行进行测定 。样品可通过过滤(如使用 0. 45 μm 孔径滤膜) 或离心去除颗粒物质 。滤膜使用前要进行饱和以降低膜吸附对受试物测定的影响 。 当测定浓度不在配制浓度的80% ~ 120%范围内时 ,效应浓度应以时间加权算术平均值表示 。

　　8.2. 1.3 试验期间 ,应至少每周测量一次所有试验容器中的溶解氧、pH 值和温度 。在测试开始和结束

　　4

　　GB/T 21854—2025

　　时测量盐度和硬度(适用于海水鱼试验) 。至少对其中一个试验容器中的温度进行连续监测 。

　　8.2.2 胚胎发育阶段

　　准确地记录试验开始时胚胎发育所处的时期 。保存有代表性的清洁的鱼卵作样本 。

　　8.2.3 孵出和存活

　　试验期间 ,应每天观察仔鱼的孵出与存活情况 ,记录数量 ,并移走死亡的胚胎 、仔鱼和幼鱼 。如在胚胎发育早期(如试验开始 2 d 内)观察到鱼卵上有真菌 ,应将这些鱼卵移除并记录 。移除死亡个体时避免磕碰周围的鱼卵或仔鱼 , 以免对其造成物理伤害 。各生活阶段的死亡判断标准如下 :

　　— 受精卵 :半透明状消失和颜色变白 ;

　　— 胚胎 、仔鱼和幼鱼 : 出现 静 止 不 动 、无 呼 吸 运 动 、无 心 跳 、对 机 械 刺 激 没 有 反 应 等 1 种 或 多 种症状 。

　　8.2.4 异常形态

　　试验期间 ,应每天记录受试生物出现畸形与异常的数量 。应注意某些鱼种可能自然发生胚胎和仔鱼的畸形 ,其在对照组中的发生率约为几个百分点 。如果畸形和异常行为非常严重 ,并且已经达到了无法恢复的程度 ,则应将其从测试中移除 , 以安乐死处理并记录为死亡个体 , 以进行后续数据分析 。

　　8.2.5 异常行为

　　试验期间 ,应每天记录受试生物的异常行为 ,如呼吸急促 、游动失调 、反常的静止和异常的摄食等 。

　　8.2.6 重量称量

　　试验结束时 ,对所有存活的鱼进行称重 ,至少以每个平行中所有存活的鱼为一组进行称重(报告每个平行受试鱼数量和平均体重) :优选湿重(吸干鱼体表面水分) ,但也可报告干重数据 。

　　8.2.7 长度测量

　　在试验结束时 ,建议逐一测量鱼体长度 , 推荐使用鱼全长 ,但如果尾鳍腐烂或腐蚀 ,应采用鱼标准长 ,难以分辨脊椎柱末端的采用鱼叉长 。可通过卡尺 、数码相机或校准的目测千分尺来测量 。在一个试验中 ,所有的鱼都应使用相同的方法进行测量 。各类受试鱼的典型最小长度见附录 A。

　　9 质量保证与质量控制

　　有效的试验满足以下的条件 :

　　a) 试验期间 ,溶解氧浓度应大于 60%的空气饱和值 ;

　　b) 试验期间 ,水温应在受试生物适宜的温度范围内 ,且每天的温度变化不应超过 ±1. 5 ℃(见附录 A) ;

　　c) 试验期间 ,试验溶液中受试物浓度应维持在平均测定值的 ±20%以内 ;

　　d) 对照组和溶剂对照组(如有) 中受精卵的总存活率和孵化后存活率大于或等于附录 A 中给出的限定值 。

　　5

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　　10 数据与报告

　　10. 1 数据处理

　　10. 1. 1 试验浓度的设计和统计方法的选择应具备足够的统计效力(80%或更高) , 以便在需要报告毒性终点 NOEC 中检测具有生物学意义的变化 。 相关效应浓度和参数的报告依据监管框架确定 。无论哪种方法 ,试验设计都应确定每个终点的百分比变化阈值 。

　　10. 1.2 基于 单 个 试 验 容 器(各 平 行) 的 试 验 数 据 进 行 统 计 分 析 。 根 据 方 差 齐 性 和 正 态 分 布 检 验 结果 ,选择合适的统计方法比较各浓度处理组与对照组之间各统计指标的差异 ,见附录 D。如果需要报告ECx ,试验设计和回归模型的选择见附录 E。 当无法获得准确的 ECx 时 ,应采用 NOEC方法 。

　　10.2 试验报告

　　试验报告应包括下列内容 。

　　a) 受试物 :

　　1) 单一成分物质 :外观 、水溶解度 、正辛醇/水分配系数 、蒸气压 、降解性等信息 ; 以及标识信息 ,如名称 、化学文摘社编号(CAS号) 、分子式 、结构式 、纯度 、杂质信息(如有)等 ;

　　2) 多组分物质 ,UVCB和混合物 : 尽可能的表征信息 , 如化学鉴定数据 、定量分析和成分的相关物理化学性质 。

　　b) 受试生物 :

　　学名 、品系 、来源 、受精卵的收集及处理方法 。

　　c) 试验条件 :

　　1) 试验程序 ,如半静态或流水式 、承载率 ;

　　2) 光周期 ;

　　3) 试验设计 ,如试验容器及其平行的数量 、每个平行中的胚胎数 、试验容器的材料和尺寸(高度 、宽度 、体积) 、每个试验容器中试验溶液的体积 ;

　　4) 贮备液制备方法及试验溶液的更新频率 ;若使用助溶剂 ,应给出其成分和浓度 ;

　　5) 受试物暴露方式 ,流水式试验应包括泵和稀释系统等信息 ;

　　6) 分析方法的定量限 、加标浓度和回收率 ,试验容器中受试物实测浓度的平均值及其标准偏差 ,及其计算方法 ;

　　7) 试验用水的 pH值 、硬度 、温度 、溶解氧浓度 、余氯(若测定) 、总有机碳 、悬浮物 、盐度(若测定)以及其他测定数据 ;

　　8) 试验期间水质情况 ,如 pH、硬度 、温度和溶解氧浓度 ;

　　9) 喂食的详细内容 ,如饵食种类 、来源 、喂食量和喂食频率 。

　　d) 试验结果 :

　　1) 对照组总存活率及是否符合该鱼种的有关标准(见附录 A) ;

　　2) 每个阶段(胚胎 、仔鱼和幼鱼)的死亡率数据和累积死亡率 ;

　　3) 孵化开始时间 、结束时间 ,孵化期间每天的孵化数 ;

　　4) 试验结束时健康鱼的数量 ;

　　5) 存活幼鱼的体长(鱼标准长或鱼全长)和体重数据 ;

　　6) 有关受试生物形态异常的描述 ,包括发生率与症状 ;

　　7) 有关受试生物行为异常的描述 ,包括发生率与症状 ;

　　8) 数据处理与统计分析方法 ;

　　9) 每个终点的 NOEC;

　　6

　　GB/T 21854—2025

　　10) 每个终点的 LOEC(p<0. 05) ;

　　11) 如可能 ,计算每个终点的 ECx 和置信限(如 95%) 和用于计算的拟合曲线 、剂量-效应曲线的斜率 、回归模型的公式 、模型参数估计值及其标准误差 。

　　e) 结果讨论 :

　　结果讨论 ,偏离及相关说明 。 当毒性测试结果与分析方法的检测限接近时 ,宜谨慎解释 。

　　7

　　GB/T 21854—2025

　　附 录 A

　　(资料性)

　　推荐鱼种的试验条件、周期和存活率

　　推荐鱼种的试验条件 、周期和存活率见表 A. 1。

　　表 A. 1 推荐鱼种的试验条件、周期和存活率

　　物种

　　试验条件

　　推荐试验周期

　　试验结束时对

　　照组鱼的最小

　　平均鱼全长a

　　mm

　　对照组存活率(最小值)

　　温度℃

　　盐度 ‰

　　光周期h

　　孵化率

　　孵化后存活率

　　淡水

　　虹鳟鱼

　　Oncorhynchus mykiss

　　10±1. 5b

　　12~ 16c

　　对照组自由摄食后 2周

　　(或孵化后 60 d)

　　40

　　75%

　　75%

　　黑头软口鲦Pimephales promelas

　　25±1. 5

　　16

　　试验开始后 32 d (或孵化后 28d)

　　18

　　70%

　　75%

　　斑马鱼

　　Daniorerio

　　26±1. 5

　　12~ 16d

　　孵化后 30 d

　　11

　　70%

　　75%

　　青鳉

　　Oryziaslatipes

　　25±2

　　12~ 16d

　　孵化后 30 d

　　17

　　80%

　　80%

　　稀有鮈鲫

　　Gobiocyprisrarus

　　25±2

　　12~ 16d

　　对照组自由摄食后 2周

　　(或孵化后 28d)

　　—

　　66%

　　70%

　　河口和海洋

　　杂色鳉

　　Cyprinodon varie- gatus

　　25±1. 5

　　15~ 35e

　　12~ 16d

　　试验开始后 32 d (或孵化后 28d)

　　17

　　75%

　　80%

　　银汉鱼属

　　Menidiasp.

　　22~ 25

　　15~ 35e

　　13

　　28d

　　20

　　80%

　　60%

　　a 鱼的最短体长不是有效性标准 ,但低于此数据 ,需要评估受试鱼的敏感性 。

　　b 特定品系的虹鳟鱼可能需要使用其他温度 ,保证亲鱼与鱼卵在相同的温度试验 。如购买鱼卵进行试验 , 至少在试验温度下适应 1 h~ 2 h。

　　c 虹鳟仔鱼需在黑暗中培养至孵化后一周(观察时间除外) ,保持 12 h~ 16h光周期至试验结束 。

　　d 试验期间光周期需恒定 。

　　e 试验期间盐度变化范围保持在 ±2‰ 。

　　8

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　推荐试验鱼种的喂养、繁殖操作要求

　　推荐试验鱼种的喂养 、繁殖操作要求见表 B. 1。

　　表 B. 1 推荐试验鱼种的喂养、繁殖操作要求

　　物种

　　饲料 *

　　孵化后转移时间

　　首次喂食时间

　　亲鱼

　　初孵仔鱼

　　幼鱼

　　种类

　　频率

　　淡水

　　虹鳟鱼

　　Oncorhynchus mykiss

　　鳟鱼食物

　　不需要a

　　鳟鱼开 口食物 BSN

　　2 次/d~ 4 次/d

　　孵化后

　　14 d ~ 16 d

　　或开始游动时

　　孵化后 19 d或开始游动时

　　黑头软口鲦Pimephales promelas

　　BSN,片状食物 FBS

　　BSN

　　BSN48,片状食物

　　2 次/d~ 3 次/d

　　孵化 90%后

　　孵化后 2 d

　　斑马鱼

　　Daniorerio

　　BSN,

　　片状食物

　　商业仔鱼食物 ,原生动物b ,蛋白质 c

　　BSN48,片状食物

　　BSN 1 次/d;

　　片状食物 2 次/d

　　孵化 90%后

　　孵化后 2 d

　　青鳉

　　Oryziaslatipes

　　片状食物

　　BSN,片状食物(或者原生动物或轮虫)

　　BSN48,片状食物(或轮虫)

　　BSN 1 次/d;片状食

　　物 2 次/d或片状食

　　物加轮虫 1 次/d

　　不适用

　　产卵后 6 d~ 7 d

　　稀有鮈鲫

　　Gobiocyprisrarus

　　FBS,BSN48

　　不需要

　　BSN48

　　2 次/d~ 3 次/d

　　不适用

　　孵化后 1 d~ 2 d

　　河口和海洋

　　杂色鳉

　　Cyprinodon varie- gatus

　　BSN,片状食物 FBS

　　BSN

　　BSN48

　　2 次/d~ 3 次/d

　　不适用

　　孵化后 1 d或开始游动时

　　银汉鱼属

　　Menidiasp.

　　BSN,片状食物

　　BSN

　　BSN48

　　2 次/d~ 3 次/d

　　不适用

　　孵化后 1 d或开始游动时

　　* 食物充足 。多余的食物和粪便应清除 , 以避免废物堆积 。

　　注 : FBS— 冷冻丰年虾 ;BSN— 新鲜孵化丰年虾 ;BSN48— 孵化 48h丰年虾 。

　　a 卵黄囊仔鱼(或称早期仔鱼)不需食物 。

　　b 混合培养过滤 。

　　c 经发酵的小颗粒 。

　　9

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　合格稀释水的化学特性

　　合格稀释水的化学特性见表 C. 1。

　　表 C. 1 合格稀释水的化学特性

　　物质

　　限定浓度

　　颗粒物

　　<5 mg/L

　　总有机碳

　　<2 mg/L

　　游离氨

　　<1μg/L

　　余氯

　　<10μg/L

　　有机磷农药总量

　　<50ng/L

　　有机氯农药与多氯联苯总量

　　<50ng/L

　　总有机氯

　　<25ng/L

　　铝

　　<1μg/L

　　砷

　　<1μg/L

　　铬

　　<1μg/L

　　钴

　　<1μg/L

　　铜

　　<1μg/L

　　铁

　　<1μg/L

　　铅

　　<1μg/L

　　镍

　　<1μg/L

　　锌

　　<1μg/L

　　镉

　　<100ng/L

　　汞

　　<100ng/L

　　银

　　<100ng/L

　　10

　　GB/T 21854—2025

　　附 录 D

　　(资料性)

　　基于不同终点的 NOEC测定的统计

　　D. 1 概述

　　统计分析均基于不同 浓 度 组 中 各 个 平 行 (单 个 容 器) 的 数 据 进 行 。 对 于 连 续 变 量 (如 体 长 和 体重) ,计算平行均值或中位数后再用于统计分析 。平行间和平行内试验数据的变异系数要求见表 D. 1。

　　表 D. 1 不同鱼种的变异系数(90%位)要求

　　物种

　　终点

　　平行间变异系数(CV)/%

　　平行内变异系数(CV)/%

　　虹鳟鱼

　　体长

　　17. 4

　　9. 8

　　体重

　　10. 1

　　28

　　黑头软口鲦

　　体长

　　16. 9

　　13. 5

　　体重

　　11. 7

　　38. 7

　　斑马鱼

　　体长

　　43. 7

　　11. 7

　　体重

　　11. 9

　　32. 8

　　D.2 溶剂对照组数据处理

　　如果使用了溶剂 ,采用 T检验或 Mann-Whitney检验 ,对稀释水对照组和溶剂对照组的各个统计指标 ,如体长 、体重 、孵化率或仔鱼死亡率 、异常率 , 以及孵化开始时间和结束时间 ,或游动开始时间与结束时间等 ,进行差异显著性比较(p等于 0. 05) 。 当两者无显著性差异时 ,将两组数据合并后用于统计分析 ;否则 ,仅采用溶剂对照组进行统计分析 ,确定 NOEC或 ECx 。

　　D.3 基于体长和体重的 NOEC确定

　　D.3. 1 基于体长和体重的 NOEC确定统计方法见图 D. 1,其中虚线框图用于孵化第一天 、最后一天 、仔鱼的游动或异常行为等效应的统计检验 。首先 ,对试验数据是否属于单调的浓度-效应关系进行直观判断 ;然后 ,采用合适的统计检验方法进行正态分布和方差齐性分析 , 以比较每个浓度处理组和对照组之间的差 异 。 正 态 分 布 检 验 可 采 用 Shapiro-Wilk或 Anderson-Darling方 法 , 方 差 齐 性 可 采 用 Levene检验 。

　　D.3.2 当数据(或经转换的数据) 服从正态分布且方差齐性时 ,选择参数检验方法 , 如 Williams检验 、递减 Jonckheere-Terpstra检 验 或 Dunnett检 验 等 ; 否 则 , 可 采 用 Dunn检 验 、Mann-Whitney检 验 或Tamhane-Dunnett(T3)检验等方法 。

　　D.3.3 注意异常值 ,并分析其对统计结果的影响 。可使用 Tukey离群值测试法 ,或通过残差直方图/茎叶图/散点图进行直观判断 ,剔除离群值时宜谨慎 。

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　　图 D. 1 大小测量的 NOEC流程图(长度和重量)

　　D.4 基于卵孵化率和仔鱼存活率的 NOEC确定

　　D.4. 1 基于孵化率和存活率的 NOEC统计分析方法见图 D. 2。统计分析前 ,先对试验数据是否属于单调的浓度-效应关系进行直观判断 ;然后 ,根据试验结果是否服从正态分布 、方差是否齐性 , 以及超二项方差是否显著[Tarone的 C(α)检验和卡方检验]选择统计检验方法 , 比较每个浓度处理组和对照组之间的差异 。每个浓度分 别 检 验 。该 检 验 可 以 看 作 是 调 整 后 的 卡 方 检 验 , 但 Tarone检 验 效 能 要 更 高 。 Tarone’sC(α)检验按公式(D. 1)进行计算 。

　　Z

　　式中 :

　　m — 重复数 ;

　　xj — 重复中有效应的数量 ,如未孵化或死亡 ;

　　nj — 第 j 个重复的生物数量 ;

　　— 给定浓度平均率的估计 。

　　D.4.2 当毒性效应呈现为单调的浓度-效应关系 ,且超二项方差不显著时 ,采用递减 Cochran-Armitage检验法 ;超二项方差显著时 ,使用 Rao-Scott改进的 Cochran-Armitage检验法(RSCA) 。此外 , 还可采用递减 Jonckheere-Terpstra检验或 Williams检验和 Dunnett检验 。

　　D.4.3 当试验数据(或 经 平 方 根 反 正 弦 转 换 后 的 数 据) 呈 现 为 非 单 调 的 浓 度-效 应 关 系 、服 从 正 态 分布 ,且方差齐性时 ,采用 Dunnett检验 。否则采用 Dunn检验 、Mann-Whitney检验法 。

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　　图 D.2 卵孵化率和仔鱼死亡率的 NOEC流程图

　　D.5 基于孵化/游动开始时间与结束时间的 NOEC确定

　　通常采用递减 Jonckheere-Terpstra检验 ,但当数据呈现为明显的非单调的浓度-效应关系 ,也可采用 Dunn检验 。

　　D.6 基于异常个体的 NOEC确定

　　统计鱼类个体异常的数量 。通常使用递减 Jonckheere-Terpstra检验 ,但当数据呈现为明显的非单调的浓度-效应关系 ,可采用 Dunn检验 。

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　　附 录 E

　　(资料性)

　　回归估计的统计

　　E. 1 概述

　　E. 1. 1 用各平行的平均值(长度和重量)或比率(卵孵化率和鱼死亡率)进行拟合 。

　　E. 1.2 在分析之前对效应进行的任何转换需保持观察的独立性 ,且 ECx 及其置信限应以原始测量单位而不是转换后单位 表 示 。 例 如 , 体 长 的 对 数 变 化 20%不 等 于 体 长 变 化 20% 。 图 E. 1 为 ECx 估 算 流程图 。

　　图 E. 1 基于体长、体重或卵孵化率或鱼死亡率的 ECx 估算流程图

　　E.2 关于卵孵化率和仔鱼死亡率的考虑

　　基于未孵化鱼卵或死亡仔鱼的比例进行建模 , 因 ECx 指的是与对照组相比 ,导致 x%受试生物出现某观察效应的受试物浓度 。如果空白对照出现死亡 ,则在计算 ECx 时需进行校正 。

　　E.3 关于体长、体重和卵孵化率或鱼存活率的 ECx 估算模型

　　下列模型可用于基于体长 、体重和卵孵化率或鱼存活率的 ECx 回归分析 。

　　a) 5个试验浓度组加对照组 :

　　1) Bruce-Versteeg;

　　2) Simple Exponential (OECD 2) ;

　　3) Exponentialwith shape parameter(OECD 3) ;

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　　4) Simple Exponentialwith LowerBound (OECD 4) 。

　　b) 6个或更多试验浓度组加上对照组 :

　　1) Exponentialwith shape parameter and lower bound (OECD 5) ;

　　2) Michaelis-Menton;

　　3) Hill;

　　4) 有明显刺激 效 应 时(不 太 可 能 在 卵 孵 化 率 或 鱼 存 活 率 中 体 现 , 但 在 大 小 观 察 中 可 能 有效应) ;

　　5) Brain-Cousins Hormetic; Brain and Cousens(1989) 。

　　E.4 基于卵未孵化率和鱼死亡率的模型选择

　　如果超二项式方差不显著 ,且在模型拟合中对空白效应进行了校正 , 可采用 probit(或 logistic) 模型对这些效应进行拟合 。

　　E.5 单一模型的拟合优度

　　具体过程如下 。

　　a) 直观比较每个测试浓度下观察到的和预测的减少百分比 。

　　b) 使用 F检验将回归误差均方与纯误差均方进行比较 。

　　c) 检查模型中的每项是否与零显著不同(即确定所有模型项是否重要) 。

　　d) 从回归分析中得到的残差与测试浓度的散点图 ,可能取对数 。该图无固定模式 ,这些点随机散布在零水平线附近 。

　　e) 附录 D评估数据的正态性和方差齐性 。

　　f) 采用附录 D 中 ANOVA残差分析方法对回归模型中残差的正态性进行评估 。 E.6 比较模型

　　具体过程如下 。

　　a) 使用 Akiaki的 AICc标准 。AICc值越小表示拟合度越好 ,如果 AICc(B)-AICc(A) 大于或等于 10,则认为模型 A 比模型 B好 。

　　b) 通过分析上述单一模型标准的符合程度 ,可视化分析比较这两个模型 。

　　c) 宜使用简约原则 ,使用最简单的模型来合理拟合数据 。

　　E.7 ECx 质量评估

　　E.7. 1 ECx 的置信限(CI)不宜太宽 。采用统计检验判定置信限范围和 ECx 有效性 。用回归模型对卵孵化率 、体长 与 体 重 数 据 进 行 拟 合 时 , ECx (x 等 于 10、20或 30) 的 75%置 信 限 范 围 不 超 过 两 个 试 验浓度 。

　　E.7.2 ECx (或任 何 其 他 模 型 参 数) 的 CI不 包 括 零 。 假 设 检 验 中 经 常 对 最 小 显 著 性 差 异 进 行 分 析 , LOEC均值效应的置信限不包含空白对照平均值 。 分析参数估计是否科学合理 。 例如 , 如果 y0的置信限为 ±20% ,则 EC10 的估计是不合理的 。如果模型预测 C 浓度下的效应为 20% ,而在 C 浓度和更低浓度下观察到的最大效应为 10% ,则 EC20合理 。

　　E.7.3 ECx 不宜在试验浓度范围之外进行外推 。通常 ,ECx 不宜小于最低试验浓度或大于最高试验浓度的 25% 。

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　　参 考 文 献

　　[1] HJ 1257—2022 化学物质环境管理 化学物质测试术语

　　[2] ASTM E1241—2022 Standard GuideforConductingEarlyLife-StageToxicity Tests withFishes

　　[3] OECD No. 23 GuidanceDocumenton AquaticToxicityTesting ofDifficultSubstancesand Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. Paris: OECD,2019.

　　[4] OECD No. 54 CurrentApproachesin the StatisticalAnalysisofEcotoxicityData: A Guid- ance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment.Paris: OECD,2006.

　　[5] OECD No. 171 Fish ToxicityTesting Framework, Environmental Health and SafetyPub- lications Series on Testing and Assessment.Paris: OECD,2012.

　　[6] OECD NO. 210 Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD Guidelines for the testing of chemicals.Paris: OECD,2013.

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