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GB/T 18653-2025 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法

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资料介绍

　　ICS 11.220 CCS B 41

　　中华人民共和国国家标准

　　GB/T 18653—2025代替 GB/T 18653—2002

　　胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法

　　Methodsfortheisolation and identification ofCampylobacterfetus

　　2025-08-29发布 2026-03-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 18653—2025

　　前言 Ⅲ

　　引言 Ⅳ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 缩略语 1

　　5 仪器设备 1

　　6 试剂和材料 2

　　7 生物安全措施 3

　　8 检验程序 3

　　9 样品采集与运输 4

　　10 样品分离与纯化 5

　　11 生化鉴定 6

　　12 PCR鉴定 7

　　13 实时荧光 PCR鉴定 9

　　14 质谱鉴定 10

　　15 综合判定 10

　　附录 A (规范性) 培养基和试剂的配制 11

　　附录 B (资料性) 胎儿弯曲杆菌菌落形态示意图 15

　　附录 C (资料性) 胎儿弯曲杆菌 PCR产物大小和测序结果对照 16

　　附录 D (资料性) 胎儿弯曲杆菌实时荧光 PCR扩增曲线 17

　　附录 E (资料性) 微生物质谱仪鉴定谱图 18

　　Ⅰ

　　GB/T 18653—2025

　　前言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　本文件代替 GB/T 18653—2002《胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法》, 与 GB/T 18653—2002相比 , 除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　— 更改了范围(见第 1 章 ,2002年版的第 1 章) ;

　　— 增加了缩略语(见第 4章) ;

　　— 更改了仪器设备、试剂和材料(见第 5 章和第 6章 ,2002年版的 2. 1,2. 2) ;

　　— 增加了生物安全措施(见第 7章) ;

　　— 更改了检验程序(见第 8章 ,2002年版的 2. 4,2. 5) ;

　　— 增加了 PCR鉴定方法(见第 12章) ;

　　— 增加了实时荧光 PCR鉴定方法(见第 13章) ;

　　— 增加了质谱鉴定方法(见第 14章) ;

　　— 更改了培养基和试剂及其配制方法(见附录 A,2002年版的附录 A) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国农业农村部提出。

　　本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

　　本文件起草单位 :南京农业大学、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、中国动物卫生与流行病学中心、中国药科大学、青岛海洋科技馆。

　　本文件主要起草人 :薛峰、申进玲、李超、曲志娜、曹钰莹、戴建君、汤芳、任建鸾、王玉英、王娟、王琳。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2002年首次发布为 GB/T 18653—2002;

　　— 本次为第一次修订。

　　Ⅲ

　　GB/T 18653—2025

　　引言

　　胎儿弯曲杆菌(Campylobacterfetus)为革兰阴性杆菌 ,呈 S 型、海鸥飞行轮廓型和螺旋状弯曲 ,无芽孢和荚膜 ,为微需氧菌 ,在严格厌氧条件下微弱生长或不生长。胎儿弯曲杆菌分为 3 个亚种 ,分别为胎儿弯曲杆菌胎儿亚种(Campylobacterfetus subsp. fetus) 、胎儿弯曲杆菌性病亚种(Campylobacter fetus subsp. venerealis) 、胎儿弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacterfetus subsp. testudinum) 。牛、羊感染胎儿弯曲杆菌胎儿亚种多会引发散发性流产 ,牛感染胎儿弯曲杆菌性病亚种会导致不育、胚胎早死和流产 ,造成严重经济损失。人类偶有胎儿弯曲杆菌胎儿亚种感染 ,一般见于孕妇或免疫低下的个体 ,依据感染部位不同常导致多种并发症。

　　Ⅳ

　　GB/T 18653—2025

　　胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法

　　1 范围

　　本文件描述了胎儿弯曲杆菌(Campylobacterfetus)的分离鉴定方法。

　　本文件适用于公畜包皮垢及精液、母畜阴道黏液、流产胎盘及胎儿的肝、肺和胃内容物等样品中胎儿弯曲杆菌的分离与鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中 , 注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB 19489 实验室生物安全通用要求

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　Ct值 :循环阈值(Cycle ThresholdValue)

　　DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)

　　rRNA:核糖体核糖核酸(RibosomalRibonucleic Acid)

　　PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

　　TEM :增菌运输培养基(TransportEnrichmentMedium)

　　PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Solution)

　　5 仪器设备

　　5. 1 荧光定量 PCR仪。

　　5.2 PCR仪。

　　5.3 DNA凝胶电泳设备。

　　5.4 高速冷冻离心机(可控温至 4 ℃ 、离心速度可达 12000g 以上) 。

　　5.5 高压灭菌器。

　　5.6 天平(感量 0. 01 g,感量 0. 000 1 g) 。

　　5.7 冰箱(2 ℃ ~ 8 ℃ 、-20 ℃或以下) 。

　　5. 8 涡旋混合器。

　　GB/T 18653—2025

　　5.9 微量移液器(0. 2 μL~ 2 μL、1 μL~ 10 μL、10 μL~ 100 μL、20 μL~ 200 μL、100 μL~ 1 000 μL,并配备与移液器匹配的吸头) 。

　　5. 10 Ⅱ级生物安全柜。

　　5. 11 微需氧培养装置(提供微需氧条件 :5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气) 。

　　5. 12 显微镜 : 目镜 10× ,物镜 10× ~ 100× 。

　　5. 13 微生物生化鉴定系统。

　　5. 14 分光光度计或核酸蛋白测定仪。

　　5. 15 麦氏比浊仪。

　　5. 16 电泳凝胶成像分析系统。

　　5. 17 微生物质谱仪(MALDI-TOF MS) 。

　　5. 18 水浴装置 :37 ℃ ±1 ℃ 、100 ℃ 。

　　5. 19 恒温培养箱。

　　5.20 人工授精(AI)吸管或卡苏吸管。

　　5.21 2 mL灭菌注射器 ,5 号针头 ,20号针头。

　　5.22 无菌离心管。

　　6 试剂和材料

　　6. 1 要求

　　除非另有规定 ,所用试剂应为分析纯 ,分子生物学试验用水应符合 GB/T 6682规定的一级水 ,其他试验用水应符合 GB/T 6682规定的二级水。

　　6.2 试剂及培养基

　　6.2. 1 5%来苏尔 :按照附录 A 中 A. 1 配制。

　　6.2.2 无菌 PBS:按照 A. 2 配制。

　　6.2.3 增菌运输培养基(TEM) :按照 A. 3 配制。

　　6.2.4 Skirrow血琼脂 :按照 A. 4 配制。

　　6.2.5 哥伦比亚血琼脂 :按照 A. 5 配制。

　　6.2.6 布氏肉汤基础培养基 :按照 A. 6 配制。

　　6.2.7 氧化酶溶液 :按照 A. 7 配制。

　　6.2. 8 3%过氧化氢溶液 :按照 A. 8 配制。

　　6.2.9 巯基乙酸盐肉汤 :按照 A. 9 配制。

　　6.2. 10 马尿酸钠水解试剂 :按照 A. 10配制。

　　6.2. 11 革兰染色液。

　　6.2. 12 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。

　　6.2. 13 琼脂糖。

　　6.2. 14 50×TAE 电泳缓冲液。

　　6.2. 15 实时荧光 PCR预混液。

　　6.2. 16 α-氰-4-羟基肉桂酸(HCCA) :色谱纯。

　　6.2. 17 基质溶液 :取 α-氰-4-羟基肉桂酸(HCCA) ,按说明书配制 ,或用市售商品。

　　6.2. 18 靶板/标本板。

　　6.2. 19 细菌 DNA提取试剂盒(商品化) 。

　　GB/T 18653—2025

　　6.3 标准菌株

　　6.3. 1 胎儿弯曲杆菌胎儿亚种 DSM5361/ATCC27374或胎儿弯曲杆菌性病亚种 ATCC19438。

　　6.3.2 大肠埃希菌标准菌株 ATCC25922。

　　6.3.3 粪肠球菌标准菌株 ATCC29212。

　　6.3.4 唾液弯曲杆菌标准菌株 DSM10535。

　　7 生物安全措施

　　实验室设施设备、人员防护及实验的安全操作、实验废弃物和菌种的处理应符合 GB 19489 的要求。

　　8 检验程序

　　胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序按照图 1进行。

　　GB/T 18653—2025

　　图 1 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序

　　9 样品采集与运输

　　9. 1 不同样品采集方法

　　9. 1. 1 动物包皮垢

　　9. 1. 1. 1 抽吸法

　　将动物用六柱栏保定 ,用绳子固定采样侧的后肢 ,剪短阴筒外部的阴毛 ,用消毒剂(如 5%来苏尔)消毒尿道口 ,将人工授精吸管或卡苏吸管插入阴筒内 ,轻轻地来回抽动吸管 , 吸取包皮液。取出吸管 ,插入盛有 3 mL灭菌生理盐水的离心管中吹吸数次 ,再将吸管放入消毒液中进行消毒处理。

　　9. 1. 1.2 冲洗法

　　将动物用六柱栏保定 ,用绳子固定采样侧的后肢 ,剪短阴筒外部的阴毛 ,用消毒剂(如 5%来苏尔)

　　GB/T 18653—2025

　　消毒尿道口 ,将无菌注射器连接无菌人工授精(AI)管 ,将 20mL~ 30mL无菌 PBS注入包皮囊 ,用力按摩 15 s~ 20 s,收集液体置于离心管中。

　　9. 1.2 动物精液

　　将动物用六柱栏保定 ,用绳子固定采样侧的后肢 ,剪短阴筒外部的阴毛 ,用消毒剂(如 5%来苏尔)消毒尿道口 ,用假阴道挤压阴茎或人工刺激的方法采集动物精液。精液样品应用无菌 PBS稀释。

　　9. 1.3 动物阴道黏液

　　9. 1.3. 1 抽吸法

　　将动物用六柱栏保定 ,用消毒剂(如 5%来苏尔)消毒外阴部 ,将 AI吸管或卡苏吸管插入阴道腔 ,直至吸管前段触及子宫颈 ,轻轻地前后移动吸管 , 吸取阴道黏液。取出吸管 ,插入盛有 3 mL灭菌生理盐水的离心管中吹吸数次 ,再将吸管放入消毒液中进行消毒处理。

　　9. 1.3.2 冲洗法

　　将动物用六柱栏保定 , 用消毒剂(如 5%来苏尔) 消毒外阴部 , 将无菌注射器连接无菌 AI管 , 将20 mL~ 30 mL无菌 PBS注入阴道腔 ,反复抽出和注入液体 4次 ~ 5 次 ,收集液体置于离心管中。

　　9. 1.4 流产胎儿与胎盘

　　无菌采集流产胎儿的肝、肺和胃内容物及胎盘 ,置于无菌塑封袋或其他密闭容器中。

　　9.2 样品保存运输

　　低温(4 ℃ ~ 8 ℃保存 ,避免直接接触冰块)微需氧环境下保存样品 ,尽快送至实验室检测。若样品不能在采样当天送达实验室 ,应将样品液静置 1 min~ 2 min,用灭菌注射器吸取上清液 1 mL, 注入增菌运输培养基(TEM)中送检。

　　10 样品分离与纯化

　　10. 1 样品分离

　　10. 1. 1 生殖道样品

　　对于采用抽吸法采集的样品 ,用无菌枪头吸取 300 μL,接种于 Skirrow 血平板上 ,在微需氧条件下37 ℃ ±1 ℃培养 3 d~ 5 d。

　　对于采用冲洗法采集的样品 ,将样品 3500g 离心去除上清液 ,加入 500μL无菌 PBS重悬 ,接种于Skirrow血平板上 ,在微需氧条件下 37 ℃ ±1 ℃培养 3 d~ 5 d。

　　10. 1.2 流产胎儿及胎盘样品

　　用接种环无菌蘸取胎儿的胃内容物 ,直接接种于 Skirrow平板上 ;胎儿的肝脏和肺脏应先用火焰做表面灭菌 ,再接种于 Skirrow平板上 ;胚胎膜用无菌 PBS冲洗 ,去除表面大部分污染物 , 刮取绒毛并接种于 Skirrow平板上。在微需氧条件下 37 ℃ ±1 ℃培养 3 d~ 5 d。

　　10. 1.3 采样当天无法送达实验室的样品

　　对于不能在采样当天送达实验室的样品 ,先将已接种样品的增菌运输培养基微需氧条件下 37℃ ± 1 ℃培养 3 d,再吸取 200 μL增菌液于 Skirrow血平板上 ,用接种环均匀划线或者涂布棒涂布均匀 ,在

　　GB/T 18653—2025

　　微需氧条件下 37 ℃ ±1 ℃培养 3 d~ 5 d。

　　10.2 样品纯化

　　取出平板 ,观察菌落形态。胎儿弯曲杆菌在 Skirrow 平板上的菌落特征为 : 灰粉色、圆形 , 中间凸起 ,表面光滑而有光泽 ,边缘规则 ,直径为 1 mm~ 3 mm ,菌落形态示意图见附录 B 中图 B. 1。如果呈现可疑菌落 ,将可疑菌落划线于哥伦比亚血平板上 ,在微需氧条件下 37 ℃ ± 1 ℃培养 3 d~ 5 d。挑取可疑菌落的纯培养物(不少于 3个)进行后续鉴定。如无可疑菌落 ,可报告胎儿弯曲杆菌为阴性。

　　10.3 形态观察

　　挑取纯化菌落 ,革兰染色、镜检。胎儿弯曲杆菌为革兰染色阴性 ,呈螺旋状或“S”状 ;一些老龄培养物可出现球状或球杆状 ,不形成芽孢和荚膜 ,在菌体的一端或两端有鞭毛。

　　10.4 动力观察

　　挑取纯化菌落 ,悬浮于 1 mL布氏肉汤中 ,用相差显微镜观察 ,胎儿弯曲杆菌呈螺旋状运动。宜使用胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株 ATCC27374为阳性对照。

　　11 生化鉴定

　　11. 1 氧化酶试验

　　用铂/铱接种环或玻璃棒挑取纯化菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上 ,如果在 10 s 内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。宜使用胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株 ATCC27374为阳性对照 , 大肠埃希菌标准菌株 ATCC25922为阴性对照。

　　11.2 过氧化氢酶试验

　　挑取纯化菌落 ,加至干净玻片上的 3%过氧化氢溶液中 , 如果在 30 s 内出现气泡则判定结果为阳性。宜使用胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株 ATCC27374为阳性对照 ,粪肠球菌标准菌株 ATCC29212为阴性对照。

　　11.3 硫化氢(H2S)试验

　　纯化菌落接种于巯基乙酸肉汤中 , 试管口悬吊一条长 × 宽为 20 mm × 6 mm 的乙酸铅滤纸 , 37 ℃ ±1 ℃微需氧环境中培养 ,观察 72 h,如见滤纸变黑即为产生 H2S, 即为硫化氢试验阳性。宜使用胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株 ATCC27374 为阳性对照 , 胎儿弯曲杆菌性病亚种标准菌株ATCC19438为阴性对照。

　　11.4 25 ℃和 42 ℃生长试验

　　挑取纯化菌落 , 接种于哥伦比亚血琼脂平板上 , 微需氧条件下 25 ℃ ± 1 ℃和 42 ℃ ± 1 ℃培养3 d,观察细菌生长情况。

　　11.5 甘氨酸、氯化钠试验

　　纯化菌落分别接种于含 1%甘氨酸或 3. 5%氯化钠的巯基乙酸肉汤中 ,37 ℃ ±1 ℃微需氧环境培养3 d,培养基近表面有云雾状生长为阳性。甘氨酸试验时 , 宜使用胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株ATCC27374为阳性对照 ,胎儿弯曲杆菌性病亚种标准菌株 ATCC19438为阴性对照 ;氯化钠试验时 ,宜使用唾液弯曲杆菌标准菌株 DSM10535为阳性对照 ,胎儿弯曲杆菌性病亚种 ATCC19438为阴性对照。

　　GB/T 18653—2025

　　11.6 马尿酸钠水解试验

　　纯化菌落接种于 0. 4 mL 1%马尿酸钠液中制成浓厚菌悬液 , 37 ℃ ± 1 ℃水浴 2 h,再加入 0. 2 mL茚三酮试剂 ,混匀后水浴 20 min观察结果 ,变深紫色为阳性 ,淡紫色或不变色为阴性。

　　注 : 上述生化试验使用商品化生化鉴定试剂盒、生化鉴定卡、微生物生化鉴定系统等按说明书进行。

　　11.7 结果判定

　　胎儿弯曲杆菌的判定按照表 1进行。符合胎儿弯曲杆菌生化特性的菌 ,判定为生化鉴定结果阳性。不符合胎儿弯曲杆菌生化特性的菌 ,判定为生化鉴定结果阴性。

　　表 1 胎儿弯曲杆菌生化反应

　　菌名

　　氧化酶试验

　　过氧化氢酶试验

　　硫化氢试验

　　生长试验

　　马尿酸钠水解试验

　　25 ℃

　　42 ℃

　　1%甘氨酸

　　3. 5%氯化钠

　　胎儿弯曲杆菌性病亚种

　　C. fetus subsp. venerealis

　　胎儿弯曲杆菌胎儿亚种

　　C. fetus subsp. fetus

　　空肠弯曲杆菌

　　C. jejuni

　　猪肠弯曲杆菌

　　C. hyointestinalis

　　n. d.

　　唾液弯曲杆菌

　　C. sputorum

　　n. d.

　　注 : “+ ”— 阳性反应 ;“- ”— 阴性反应 ;“V”— 反应不定 ;“n. d. ”— 未确定。

　　a 空肠弯曲杆菌空肠亚种阳性 ,空肠弯曲杆菌德莱亚种不确定。

　　b 虽然胎儿弯曲杆菌不属于嗜热弯曲菌 ,相当多的菌株可在 42 ℃生长。

　　c 空肠弯曲杆菌空肠亚种阳性 ,空肠弯曲杆菌德莱亚种阴性。

　　12 PCR鉴定

　　12. 1 DNA模板的制备

　　从哥伦比亚血琼脂上挑取 4个 ~ 5个胎儿弯曲杆菌疑似单菌落于 500 μL无菌水中混匀 ,放置于干式恒温金属浴中 10 min,冷却后 ,12000g离心 2 min,上清液即为 DNA模板。获得的 DNA模板立即使用或放入 -20℃冰箱保存备用。

　　也可使用等效的商品化细菌 DNA提取试剂盒并按其说明书制备 DNA模板。

　　12.2 PCR扩增

　　12.2. 1 引物

　　按照表 2信息合成胎儿弯曲杆菌引物。

　　GB/T 18653—2025

　　表 2 胎儿弯曲杆菌 PCR检测用引物信息

　　组分名称

　　序列

　　目的基因

　　片段长度

　　MG3F

　　GGT AGC CGC AGC TGC TAA GAT

　　cstA

　　764bp

　　MG4R

　　TAG CTA CAA TAA CGA CAA CT

　　12.2.2 对照设置

　　检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。使用胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株ATCC27374或胎儿弯曲杆菌性病亚种标准菌株 ATCC19438为阳性对照 ,使用除胎儿弯曲杆菌之外的一株其他弯曲杆菌标准菌株为阴性对照 , 以无菌去离子水为空白对照。

　　12.2.3 PCR反应体系

　　胎儿弯曲杆菌 PCR检测反应体系按照表 3 配制。

　　表 3 胎儿弯曲杆菌 PCR反应体系

　　组分名称

　　体积/μL

　　PCR预混液(2×)

　　12. 5

　　上游引物(10 μmol/L)

　　1. 0

　　下游引物(10 μmol/L)

　　1. 0

　　DNA模板

　　2. 0

　　无菌去离子水

　　8. 5

　　总量

　　25. 0

　　12.2.4 PCR反应程序

　　95 ℃预变性 3 min;95℃变性 30 s,54℃退火 30 s,72℃延伸 1 min,30个循环;72℃延伸 10min。

　　12.3 电泳

　　用 1×TAE 电泳缓冲液配制 1. 5 %的琼脂糖凝胶平板(含 1 μL/mL EB或 EB替代物) ,凝固后放入水平电泳槽 ,使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述扩增产物 5 μL样品加入样品孔 ,使用 DNA 分子质量标准参照物作对照。 100V 电泳 25min~ 35min, 当指示剂到达凝胶底部约 1/3时停止 ,于凝胶成像仪观察电泳条带(约 764bp) 。

　　12.4 结果判定

　　质控系统 : 阳性对照出现预期大小的扩增条带 , 阴性对照和空白对照均未出现预期大小的扩增条带 ,则试验成立。以上要求应在同一次试验中同时满足 ,否则 ,本次试验无效。

　　阳性结果 :在试验成立的情况下 ,待测样品出现预期大小的扩增条带 ,判定 PCR结果为阳性。

　　阴性结果 :在试验成立的情况下 ,待测样品未出现预期大小的扩增条带 ,判定 PCR结果为阴性。

　　PCR产物电泳图见附录 C 中 C. 1。

　　GB/T 18653—2025

　　13 实时荧光 PCR鉴定

　　13. 1 DNA模板的制备同 12. 1。

　　13.2 实时荧光 PCR扩增

　　13.2. 1 引物探针

　　按照表 4信息合成引物探针。

　　表 4 胎儿弯曲杆菌实时荧光 PCR检测用引物探针信息

　　组分名称

　　序列

　　目的基因

　　片段长度

　　16SFw

　　5'-GCACCTGTCTCAACTTTC-3'

　　16S rRNA

　　78bp

　　16SRv

　　5'-CCTTACCTGGGCTTG AT-3'

　　16SPb

　　5'-VIC-ATCTCTAAGAGATTAGTTG- MGB/NFQ-3'

　　13.2.2 对照设置同 12. 2. 2。

　　13.2.3 实时荧光 PCR反应体系

　　胎儿弯曲杆菌实时荧光 PCR反应体系按照表 5 配制。

　　表 5 胎儿弯曲杆菌实时荧光 PCR反应体系

　　组分名称

　　体积/μL

　　实时荧光 PCR预混液(2×)

　　10. 0

　　上游引物(10 μmol/L)

　　0. 4

　　下游引物(10 μmol/L)

　　0. 4

　　探针(10 μmol/L)

　　0. 2

　　DNA模板

　　4. 0

　　无菌去离子水

　　5. 0

　　总量

　　20. 0

　　13.2.4 实时荧光 PCR反应程序

　　95 ℃预变性 5 min;95 ℃变性 10 s,60 ℃退火 30 s,40个循环;70 ℃终延伸 5 min(60 ℃时设置采集荧光信号;PCR反应参数可根据荧光定量 PCR试剂以及仪器进行适当调整) 。

　　13.3 结果判定

　　质控系统 :读取每个样品 Ct值。阳性对照有特异性 S 型扩增曲线而且 Ct值 ≤30, 阴性对照和空白

　　GB/T 18653—2025

　　对照无特异性 S型扩增曲线 ,说明试验成立。以上要求应在同一次试验中同时满足 ,否则 ,本次试验无效。胎儿弯曲杆菌标准菌株实时荧光 PCR扩增曲线见附录 D 中 D. 1。

　　阳性结果如下 :

　　a) 在试验成立的情况下 , 待测样品有特异性 S 型扩增曲线 , 且 Ct值 ≤35, 则判定为实时荧光PCR结果阳性 ;

　　b) 在试验成立的情况下 ,待测样品有特异性 S 型扩增曲线 ,且 35

　　阴性结果 :在试验成立的情况下 , 被检样品无特异性 S 型扩增曲线 , 判定为实时荧光 PCR 结果阴性。

　　14 质谱鉴定

　　14. 1 菌样制备

　　分别挑取单个新鲜纯化菌落 ,均匀涂布于靶板样品孔中 ,室温干燥。吸取 1 μL基质溶液 ,滴于样品上 ,混匀 ,室温干燥。将胎儿弯曲杆菌标准菌株的新鲜菌落同法操作。

　　14.2 仪器自检

　　检测样品前 ,应对微生物质谱仪进行自检。

　　14.3 测定

　　取制备好的样品靶板置质谱仪靶板槽中。编辑样品信息后 ,进行谱图数据采集。

　　14.4 结果判定

　　微生物质谱仪自动完成谱的图比对和鉴定。以不同颜色、不同分值显示结果 ,菌株鉴定位点显示绿色 ,鉴定分值达到种水平可信即可。胎儿弯曲杆菌标准菌株的质谱鉴定谱图见附录 E 中 E. 1。

　　15 综合判定

　　生化鉴定试验为必做项目 ,若生化鉴定结果为阴性 ,则该菌为非胎儿弯曲杆菌。

　　若生化鉴定结果为阳性 ,则选择 PCR鉴定、实时荧光 PCR鉴定和质谱鉴定中的任一种方法进行确认。若任一种方法确认结果为阳性 ,则该菌为胎儿弯曲杆菌。

　　GB/T 18653—2025

　　附录 A

　　(规范性)

　　培养基和试剂的配制

　　A. 1 5%来苏尔

　　配制 5%来苏尔所需试剂如下 :

　　— 500. 0 mL 的甲酚 ;

　　— 173. 0 g 的植物油 ;

　　— 27. 0 g 的氢氧化钠。

　　将 500. 0 mL 的甲酚、173. 0 g 的植物油、27. 0 g 的氢氧化钠依次溶解于无菌蒸馏水中 , 定容至1 000 mL配制成 50%的来苏尔 ,取 5 mL50%来苏尔 ,加 95 mL无菌蒸馏水 , 即得 5%来苏尔。

　　A.2 无菌 PBS

　　配制无菌 PBS所需试剂如下 :

　　— 8. 0 g 的氯化钠 ;

　　—0. 2 g 的氯化钾 ;

　　— 1. 44 g 的磷酸氢二钠 ;

　　—0. 24 g 的磷酸二氢钾 ;

　　— 1 000. 0 mL 的蒸馏水。

　　将 8. 0 g 的氯化钠、0. 2 g 的氯化钾、1. 44 g 的磷酸氢二钠、0. 24 g 的磷酸二氢钾依次溶解于800 mL蒸馏水中 ,用浓度为 36 %的 HCl调节溶液至 pH 7. 4,最后加蒸馏水定容至 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌15 min,备用。

　　A.3 增菌运输培养基(TEM)

　　配制 TEM所需试剂如下 :

　　— 1 000. 0 mL 的胎牛血清 ;

　　—0. 3 g 的 5-氟尿嘧啶 ;

　　—0. 1 g 的放线菌酮 ;

　　— 3. 0 mg的萘啶酮酸 ;

　　— 100 000 IU 的多黏菌素 B;

　　— 5. 0 mL 的 1%煌绿。

　　无菌操作环境下 ,在 1 000. 0 mL 的胎牛血清中依次加入 0. 3 g 的 5-氟尿嘧啶、0. 1 g 的放线菌酮、 3. 0 mg的萘啶酮酸、100000IU 的多黏菌素 B、5. 0 mL 的 1%煌绿 ,充分混合后分装于 20mL带胶皮塞(能密闭)的玻璃瓶中 ,每瓶 8 mL,然后水浴或在蒸汽中加热 2 min~ 3 min(无压力) ,使血清凝固 ,冷却后用灭菌玻璃棒将血清凝块捣碎。最后无菌操作充入混合气体[5%氧气(O2 ) 、10%二氧化碳(CO2 ) 、 85%氮气(N2 )] 。将制备好的 TEM培养基保存在 4 ℃冰箱中 ,可使用 4个月。

　　A.4 Skirrow 血琼脂(Skirrow blood agar)

　　A.4. 1 基础培养基

　　配制 Skirrow血琼脂的基础培养基所需试剂如下 :

　　GB/T 18653—2025

　　— 15. 0 g 的蛋白胨 ;

　　— 2. 5 g 的胰蛋白胨 ;

　　— 5. 0 g 的酵母浸膏 ;

　　— 5. 0 g 的氯化钠 ;

　　— 15. 0 g 的琼脂 ;

　　— 1 000. 0 mL 的蒸馏水。

　　将 15. 0 g 的蛋白胨、2. 5 g 的胰蛋白胨、5. 0 g 的酵母浸膏、5. 0 g 的氯化钠、15. 0 g 的琼脂依次溶于1 000. 0 mL的蒸馏水中 ,121 ℃灭菌 15 min,备用。

　　A.4.2 FBP溶液

　　配制 Skirrow血琼脂的 FBP溶液所需试剂如下 :

　　—0. 25 g 的丙酮酸钠 ;

　　—0. 25 g 的焦亚硫酸钠 ;

　　—0. 25 g 的硫酸亚铁 ;

　　— 100 . 0 mL 的蒸馏水。

　　将 0. 25 g 的丙酮酸钠、0. 25 g 的焦亚硫酸钠、0. 25 g 的硫酸亚铁溶于 100. 0 mL 蒸馏水中 , 经0. 22 μm滤膜过滤除菌。FBP根据需要量现用现配 ,在 -70℃储存不超过 3 个月或 -20℃储存不超过1个月。

　　A.4.3 抗生素溶液

　　配制 Skirrow血琼脂抗生素溶液所需试剂如下 :

　　—0. 007 5 g 的万古霉素 ;

　　—0. 003 8 g 的三甲氧苄二氨嘧啶 ;

　　— 1 900 IU 的多黏菌素 B;

　　—0. 037 5 g 的放线菌酮 ;

　　— 5. 0 g 的两性霉素 B;

　　— 5. 0 mL 的乙醇/无菌蒸馏水(体积比 50 ∶ 50) 。

　　将 0. 0075 g 的万古霉素、0. 0038 g 的三甲氧苄二氨嘧啶、1900IU 的多黏菌素 B、0. 0375 g 的放线菌酮、5. 0 g 的两性霉素 B溶解于 5. 0 mL乙醇/无菌蒸馏水混合溶液中。

　　A.4.4 无菌脱纤维绵羊血

　　无菌操作条件下 ,将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中 ,振摇约 10 min,静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。

　　A.4.5 完全培养基

　　配制 Skirrow血琼脂完全培养基所需试剂如下 :

　　— 1 000. 0 mL 的基础培养基(A. 4. 1) ;

　　— 5. 0 mL 的 FBP溶液(A. 4. 2) ;

　　— 5. 0 mL 的抗生素溶液(A. 4. 3) ;

　　— 50. 0 mL 的无菌脱纤维绵羊血(A. 4. 4) 。

　　取 1 000. 0 mL 的基础培养基 ,加热,当基础培养基的温度约为 45 ℃时 ,加入 5. 0 mL 的 FBP溶液、 5. 0 mL 的抗生素溶液与冻融的 50. 0 mL 的无菌脱纤维绵羊血 ,混匀。调节 pH 至 7. 4±0. 2(25℃) 。倾注 15 mL于无菌平皿中 ,静置至培养基凝固。预先制备的平板未干燥时在室温放置不应超过 4 h,或在

　　GB/T 18653—2025

　　4 ℃左右冷藏不应超过 7 d。

　　A.5 哥伦比亚血琼脂

　　A.5. 1 基础培养基

　　配制哥伦比亚血琼脂基础培养基所需试剂如下 :

　　— 15. 0 g 的动物组织酶解物 ;

　　— 1. 0 g 的淀粉 ;

　　— 5. 0 g 的氯化钠 ;

　　— 8. 0 g~ 18. 0 g 的琼脂 ;

　　— 1 000. 0 mL 的蒸馏水。

　　将 15. 0 g 的动物组织酶解物、1. 0 g 的淀粉、5. 0 g 的氯化钠、8. 0 g~ 18. 0 g 的琼脂依次溶于1 000. 0 mL的蒸馏水中 ,121 ℃灭菌 15 min,备用。

　　A.5.2 无菌脱纤维绵羊血

　　无菌操作条件下 ,将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中 ,振摇约 10 min,静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。

　　A.5.3 完全培养基

　　配制哥伦比亚血琼脂完全培养基所需试剂如下 :

　　— 1 000. 0 mL 的基础培养基 ;

　　— 50. 0 mL 的无菌脱纤维绵羊血。

　　取 1 000. 0 mL 的基础培养基 ,加热,当基础培养基的温度为 45 ℃左右时 ,无菌加入 50. 0 mL 的无菌脱纤维绵羊血 ,混匀。调节 pH 至 7. 3±0. 2(25 ℃) 。倾注 15 mL 完全培养基于无菌平皿中 ,静置至培养基凝固。制备的平板未干燥时在室温放置不应超过 4 h,或在 4 ℃左右冷藏不应超过 7 d。

　　A.6 布氏肉汤基础培养基

　　配制布氏肉汤基础培养基所需试剂如下 :

　　— 10. 0 g 的酪蛋白酶解物 ;

　　— 10. 0 g 的动物组织酶解物 ;

　　— 1. 0 g 的葡萄糖 ;

　　— 2. 0 g 的酵母浸膏 ;

　　— 5. 0 g 的氯化钠 ;

　　—0. 1 g 的亚硫酸氢钠 ;

　　— 1 000. 0 mL 的蒸馏水。

　　将 10. 0 g 的酪蛋白酶解物、10. 0 g 的动物组织酶解物、1. 0 g 的葡萄糖、2. 0 g 的酵母浸膏、5. 0 g 的氯化钠、0. 1 g 的亚硫酸氢钠溶于 1 000. 0 mL蒸馏水中 , 调节 pH 至 7. 0±0. 2(25 ℃) , 121 ℃高压灭菌15 min,备用。

　　A.7 氧化酶溶液

　　配制氧化酶溶液所需试剂如下 :

　　— 1. 0 g 的四甲基对苯二胺盐酸盐 ;

　　— 100. 0 mL 的蒸馏水。

　　GB/T 18653—2025

　　将 1. 0 g 的四甲基对苯二胺盐酸盐溶解于 100. 0 mL 的蒸馏水中 ,使用前将充分混匀。

　　A. 8 3%过氧化氢(H2O2 )

　　配制 3%过氧化氢(H2 O2 )所需试剂如下 :

　　— 10. 0 mL 的 30% 过氧化氢(H2 O2 )溶液 ;

　　— 90. 0 mL 的蒸馏水。

　　吸取 10. 0 mL 30%过氧化氢(H2 O2 )溶液 ,溶于 90 mL蒸馏水中 ,混匀 ,分装备用。

　　A.9 巯基乙酸盐肉汤

　　配制氧化酶所需试剂如下 :

　　—0. 5 mg的 L-胱氨酸 ;

　　— 2. 5 mg的氯化钠 ;

　　— 5. 5 g 的右旋糖 ;

　　— 5. 0 g 的酵母浸膏 ;

　　— 15. 0 g 的酪蛋白胰酶消化物(Pancreatic DigestofCasein) ;

　　—0. 5 g 的巯基乙酸钠 ;

　　— 1 000. 0 mL 的蒸馏水。

　　将 0. 5 mg的 L-胱氨酸、2. 5 mg的氯化钠、5. 5 g 的右旋糖、5. 0 g 的酵母浸膏、15. 0 g 的酪蛋白胰酶消化物、0. 5 g 的巯基乙酸钠依次溶解于 1 000. 0 mL 的蒸馏水中 , 加热至溶解 , 调节 pH 至 7. 2±0. 2, 5 mL试管分装 ,121 ℃高压灭菌 15 min,新制备的培养基均应做无菌检查 , 以保证培养基的质量。

　　A. 10 马尿酸钠水解试剂

　　A. 10. 1 马尿酸钠溶液

　　配制马尿酸钠溶液所需试剂如下 :

　　— 1. 0 g 的马尿酸钠 ;

　　— 8. 5 g 的氯化钠 ;

　　— 8. 98 g 的磷酸氢二钠 ;

　　— 2. 71 g 的磷酸二氢钠 ;

　　— 1 000. 0 mL 的蒸馏水。

　　先将 8. 5 g 的氯化钠、8. 98 g 的磷酸氢二钠、2. 71 g 的磷酸二氢钠依次溶解于 1 000. 0 mL 的蒸馏水 ,配制成磷酸盐缓冲液。

　　再将 1. 0 g 的马尿酸钠溶于磷酸盐缓冲溶液中 , 过滤除菌。无菌分装 , 每管 0. 4 mL, 储存于-20 ℃ 。

　　A. 10.2 3.5%(水合)茚三酮溶液

　　配制 3. 5%(水合)茚三酮溶液所需试剂如下 :

　　— 3. 5 g 的(水合)茚三酮 ;

　　— 50. 0 mL 的丙酮 ;

　　— 50. 0 mL 的丁酮。

　　将(水合)茚三酮溶解于丙酮/丁醇预混液中。该溶液在避光冷藏时不超过 7 d。

　　GB/T 18653—2025

　　附录 B

　　(资料性)

　　胎儿弯曲杆菌菌落形态示意图

　　胎儿弯曲杆菌标准菌株 DSMZ5361在 Skirrow血琼脂上生长形态见图 B. 1。

　　图 B. 1 Skirrow 血琼脂上胎儿弯曲杆菌标准菌株 DSMZ5361菌落形态

　　GB/T 18653—2025

　　附录 C

　　(资料性)

　　胎儿弯曲杆菌 PCR产物大小和测序结果对照

　　胎儿弯曲杆菌标准菌株 cstA PCR产物电泳图见图 C. 1。

　　标引序号说明 :

　　M —DL2000DNA Marker;

　　Neg. — negative control;

　　cff. — 胎儿弯曲杆菌胎儿亚种 DSMZ 5361。

　　图 C. 1 胎儿弯曲杆菌标准菌株 DSMZ5361cstA PCR产物电泳图

　　GB/T 18653—2025

　　附录 D

　　(资料性)

　　胎儿弯曲杆菌实时荧光 PCR扩增曲线

　　胎儿弯曲杆菌标准菌株实时荧光 PCR扩增曲线见图 D. 1。

　　图 D. 1 胎儿弯曲杆菌标准菌株 DSMZ5361实时荧光 PCR扩增曲线

　　GB/T 18653—2025

　　附录 E

　　(资料性)

　　微生物质谱仪鉴定谱图

　　胎儿弯曲杆菌标准菌株质谱鉴定谱图见图 E. 1。

　　图 E. 1 胎儿弯曲杆菌标准菌株 ATCC27374质谱鉴定谱图

GB/T 18669-2025 船用锚链和系泊链钢

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