T/CVDA 2-2024 间充质干细胞治疗犬糖尿病技术

ICS 11.220

B 41

T/CVDA

团体 标准T/CVDA 2-2024

间充质干细胞治疗犬糖尿病技术

Mesenchymal cell therapy for canine diabetes

2024-07-01 发布 2024-07-01 实施

中国兽药协会发布

目录

前言 1

间充质干细胞治疗犬糖尿病技术 2

1. 范围 2

2. 规范性引用文件 2

3. 术语和定义 2

3.2 糖尿病 dia bete s 2

3.3 血糖 blood glu co se 2

3.4 尿糖 urin e glu cos e 3

4. 缩略语 3

5. 犬间充质干细胞技术要求 3

5.1 原材料和辅料 3

5.2 关键质量属性 3

6. 犬间充质干细胞检验方法 4

6.1 供体犬筛选 4

6.2 细胞形态 4

6.3 染色体核型 4

6.4 细胞存活率 4

6.5 细胞表面标志物 4

6.6 免疫调节 5

6.7 三系分化 5

6.8 成瘤性 5

6.9 微生物 5

7.检验规则 6

7.1 抽样方法和数量 6

7.2 出厂检验 6

7.3 判定规则 6

8. 使用说明 6

9. 标签 7

10. 包装，储存和运输 7

10.1 包装 7

10.2 储存 7

10.3 运输 7

11.犬间充质干细胞治疗犬糖尿病 7

11.1犬糖尿病的诊断 7

11.2 犬糖尿病的治疗方法 7

附录 A 10

附录 B 11

附录 C 13

附录 D 15

附录 E 17

附录 F 19

附录 G 22

附录 H 23

附录 I 24

附录 J 25

前言

本标准按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本标准由中国兽药协会提出并归口。

本标准起草单位：百欧派(天津)生物技术有限公司、维赛(佛山)生物科技有限公司、西北农林科技大学、佛山科学技术学院。

本标准主要起草人：赵献军、王丙云、华进联、李东升、白春娜、陈胜锋、张翊华、李星颖、魏强、詹小舒。

本标准名称：间充质干细胞治疗犬糖尿病技术

11111

1. 范围

本文件规定了治疗用犬间充质干细胞的技术要求、检验方法、检验规则、使用说明、标签、包装、储存、运输、废弃物处理要求、犬糖尿病诊断标准和犬糖尿病间充质干细胞治疗方案。

本文件适用于犬间充质干细胞的生产、检测、质控和指导犬糖尿病的间充质干细胞治疗。

2. 规范性引用文件

下列文件中的内容通过本文件的规范性引用而成为本文件必不可少的条款。

凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

T/CSCB 0001 干细胞通用要求

中华人民共和国兽药典(2020 年版)

GB/T 27532-2011犬瘟热诊断技术

GB/T 27533-2011犬细小病毒病诊断技术

WS281-2008 狂犬病诊断标准

2018 AAHA 犬猫糖尿病管理指南

3. 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1 犬间充质干细胞 Canine mes enchy mal stem cell

一类贴壁培养后呈成纤维细胞样形态(纺锤形或梭形)、可在体外自我更新并具有成骨、成脂、成软骨等分化能力的干细胞。

注：犬间充质干细胞可由多种组织(如骨髓、脐带、胎盘、羊膜、脂肪、脐带血等)分离得到， 也可以通过分化或转分化等方式获得; 不同来源的犬间充质干细胞在基因表达谱和分化能力方面存一定差异， 但具有类似的基本生物学特性。

3.2 糖尿病 diabetes

由多种病因引起的代谢紊乱，犬空腹血糖浓度持续达到 8.4 mmol/L 或食后血糖浓度持续达到 11.2 mmol/L，即可诊断为糖尿病。其特点是慢性高血糖，伴有胰岛素分泌不足和(或)作用障碍，导致碳水化合物、脂肪、蛋白质代谢紊乱，造成多种器官的慢性损伤、功能障碍甚至衰竭。

3.3 血糖 blood glucose

血液中的葡萄糖，用 mmol/L 表示，犬血糖参考值为3.3 mmol/L～6.7 mmol/L。犬应激时，有时血糖可达 9.7 mmol/L，但持续几小时或几天，便恢复正常。

3.4 尿糖 urine glucose

尿液中的葡萄糖，当血糖浓度增高到一定程度时，肾小管不能将尿液中的葡萄糖全部重吸收，尿糖增高呈阳性，临床用 “+” 号表示。一般情况下，尿糖可以反映出血糖的情况，但尿糖还受其他许多因素的影响，有时与血糖并不完全一致。

4. 缩略语

CD--分化簇 (Cluster of Differentiation )

CDV -- 犬瘟热(Canine distemper)

CPV--犬细小病毒(Canine Parvo virus )

IDO -- 吲哚胺 2,3-双加氧酶(Indoleamine 2, 3 Dioxygen ase )

IFN - γ -- 干扰素 γ ( Interferon gamma)

MSC --间充质干细胞( Canine mesenchymal stem cell )

RV--狂犬病毒(Rabies virus )

STR-- 短串联重复序列 (Short Tandem Repeat)

TNF- α-- 肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor- α)

5. 犬间充质干细胞技术要求

5.1 原材料和辅料

5.1.1 应符合 T/CSCB 0001 要求。

5.1.2 应建立供体细胞采集的供体犬评估与筛选标准、采集方法、运输标准和交接标准，保证动物福利和细胞的安全。

5.1.3 供体犬应符合国家普通级动物标准。具体引用标准为 GB 14922.2-2011《实验动物微生物学等级及监测》。

5.2 关键质量属性

5.2.1 细胞形态

细胞贴壁培养时呈纺锤形或梭形的成纤维细胞态，形态均一。

5.2.2 染色体核型

正常核型应为 78, XX 或 78，XY。

5.2.3 细胞存活率

未冻存细胞存活率≥95 %，且冻存复苏后细胞存活率≥90%。

5.2.4 细胞代次

用于治疗的细胞为 P3-P6 代细胞。

5.2.5 细胞标志蛋白

在体外培养条件下，CD29、CD4 4、CD 90 阳性率≥ 95 %; CD 34、CD45 阳性率≤ 2 %。

5.2.6 免疫调节

经炎症因子 IFN-γ 诱导后显著增强犬 MSC 表达吲哚胺 2,3-双加氧酶(IDO)。与活化的 T 淋巴细胞共培养，能抑制 T 淋巴细胞增殖及分泌 IFN- γ 和 TNF-α。除上述列举的方法外，也可采用其他具有药理学依据的检测方法。

5.2.7 三系分化

具有成骨、成脂、成软骨的分化潜能。

5.2.8 成瘤性

免疫缺陷动物(如裸鼠)体内成瘤试验结果为阴性。

5.2.9 微生物

真菌、细菌、支原体、内毒素、犬瘟热(CDV)、犬细小病毒(CPV)、狂犬病(RV)、犬传染性肝炎(ICH)、犬冠状病毒(CCV)应为阴性。

5.3 细胞制备过程控制

5.3.1 MSC 的扩增、冻存、复苏等过程控制应符合 T/CSCB 0001 要求。

5.3.2 MSC 的细胞 STR 检测结果应与供体细胞保持一致。

6. 犬间充质干细胞检验方法

6.1 供体犬筛选

按照附录 A 的方法进行筛选

6.2 细胞形态

二维培养条件下，用明视场细胞显微镜进行观察。

6.3 染色体核型

按照《中华人民共和国兽药典(2020 年版)》三部 -3502《生产用细胞标准》中 3.2.4 胞核学检验标准进行检验。

6.4 细胞存活率

按照附录 B 的方法检验。

6.5 细胞表面标志物

按照附录 C 的方法检验。

6.6 免疫调节

6.6.1 诱导 IDO 表达

按照附录 D 的方法检验。

6.6.2 抑制 T 细胞增殖按照附录 E 的方法检验。

6.6.3 抑制 T 细胞分泌 IFN-γ, TNF-α按照附录 F 的方法检验。

6.7 三系分化

6.7.1 成骨分化

按照附录 G 的方法检验。

6.7.2 成脂分化

按照附录 H 的方法检验。

6.7.3 成软骨分化

按照附录 I 的方法检验。

6.8 成瘤性

按照附录 J 的方法检验。

6.9 微生物

6.9.1 真菌

按照《中国兽药典(2020 年版)》三部中“3306 无菌检验或纯粹检验法”项检测。

6.9.2 细菌

6.9.3 病毒

按照《中华人民共和国兽药典》2020 版第三部中“3305 外源病毒检验法”项检测。 6.9.4 支原体

按照《中国兽药典(2020 年版)》三部中“3308 支原体检验法”项检测。

6.9.5 内毒素

按照《中国兽药典(2020 年版)》一部中“1143 细菌内毒素检验法”检测。

6.9.6 CDV

按照国家标准 GB/T 27532-2011《犬瘟热诊断技术》检测。

6.9.7 CPV

按照国家标准 GB/T 27533-2011《犬细小病毒病诊断技术》检测。

6.9.8 RV

按照国家标准 WS281-2008《狂犬病诊断标准》检测。

6.9.9 ICH

按照国家标准 GB/T 14926.58-2008《传染性犬肝炎病毒检测方法》检测。

6.9.10 CCV

按照地方标准 DB21/T 3093-2018《犬冠状病毒检测方法》检测。

7.检验规则

7.1 抽样方法和数量

7.1.1 在同一个生产周期中，同一生产线，同一来源，同一代次，同一方法制备出来的产品为一批。

7.1.2 在同一批的产品中随机抽取 3 个最小包装单元。

7.2 出厂检验

7.2.1 每批产品应进行出厂检验，并附检验报告。

7.2.2 出厂检验项目应包括 5.2 规定的所有项目。

7.3 判定规则

7.3.1 出厂检验项目全部符合 5.2 规定，判为合格品;有 1 项及以上不符合本文件规定，则判为不合格品。

7.3.2 复核检验项目全部符合 5.2 规定，判为合格品;有 1 项及以上不符合本文件规定，则判为不合格品。

8. 使用说明

应至少包括以下内容：

a)产品名称;

b)细胞数量;

c)生产日期;

d)生产批号;

e)生产组织;

f)储存条件及使用期限;

g)运输条件;

h)使用方法;

i)执行标准号;

j)生产地址;

k)联系方式;

l) 邮政编码;

m)注意事项。

9. 标签

e)生产单位。

10. 包装，储存和运输

10.1 包装

应选择对犬间充质干细胞关键质量属性无影响的材料和容器。

10.2 储存

10.2.1 应符合 T/CSCB 0001 要求。

10.2.2 为保证细胞活力，细胞应在低于-130℃(可保存 12 个月)或-80℃环境(可保存 3 个月)下储存。

10.3 运输

10.3.1 应符合 T/CSCB 0001 要求。

10.3.2 冻存细胞应在干冰或低于 -130℃条件下运输，非冻存细胞建议在 4℃~25℃运输。

11.犬间充质干细胞治疗犬糖尿病

11.1 犬糖尿病的诊断

应符合 2018 AAHA 犬猫糖尿病管理指南的诊断方法。

11.2 犬糖尿病的治疗方法

11.2.1 细胞注射剂量：1×106-7个/kg 体重。

11.2.2 细胞注射次数：早期糖尿病患犬(食后血糖值范围 11.1 mmol/L～16.7 mmol/L)，

15～30 d 移植 1 次， 1～3 次为一个疗程，间隔 3～6 个月进行第二个疗程，具体移植次数和治疗疗程要根据病情及血糖检测结果确定;中晚期糖尿病患犬(食后血糖值超过 16.7 mmol/L)，

15～30 d 移植 1 次，3～5 次为一个疗程，间隔 3～6 个月进行第二个疗程，具体移植次数和治疗疗程要根据病情及血糖检测结果确定。每个疗程首次剂量加倍。严重病例需配合胰岛素等进行治疗，根据血糖变化，逐步减少胰岛素用量。

11.2.3 细胞注射方法：使用≥7.5 号注射器针头抽吸细胞加入患猫所需输液量的生理盐水中，轻柔晃动混匀后，使用输血器进行静脉滴注或去掉滤网的输液器进行静脉滴注，滴注速度不宜

过快，每隔 15～20 min 摇动一次生理盐水瓶，防止细胞沉淀，于 1 h 内滴注完成。

附件:

附录 A：供体犬评估与筛选，犬组织样品采集和运输标准

附录 B：细胞存活率检测，细胞计数法

附录 C：细胞标志蛋白检测，流式细胞法

附录 D：诱导 IDO 表达检测，PCR 法

附录 E：抑制 T 细胞增殖检测，CFSE 标记法

附录 F：抑制 T 细胞分泌 IFN-γ、TNF-α 检测胞内因子染色法

附录 G：成骨分化检测，茜素红 S 染色法

附录 H：成脂分化检测，油红 O 染色法

附录 I：成软骨分化检测，阿尔新蓝染色法

附录 J：成瘤性检测，免疫缺陷小鼠检测法

附录 K：犬间充质干细胞治疗犬糖尿病的方法

附录 A

(规范性)

供体犬评估与筛选，犬组织样品采集和运输标准

A.1 供体犬筛选标准

A.1.1 供体犬年龄应不大于 5 岁(60 个月)，以确保供体犬没有出现明显衰老迹象。

A.1.2 健康状况筛查: 供体犬应由专业兽医进行全面的健康评估，包括体格检查, 血液检查，并且具有有效的疫苗接种记录(至少包含犬瘟热，犬细小和狂犬病疫苗)，确保没有潜在的遗传或者传染疾病。

A.1.3 品种和遗传背景：供体犬的品种信息和遗传背景应当有完整记录，以排除潜在的遗传风险或疾病。

A.1.4 心理和行为特征筛查：供体犬应具有良好的心理和行为特征。挑选脾气稳定，友好和适应新环境的犬作为供体，以减少在组织采集和实验过程中的应激和不适感。

A.2 犬组织采集方法

A.2.1 用于干细胞分离的犬组织的采集应获得当地动物福利和伦理委员会的批准。

A.2.2 麻醉与镇定：使用合适的麻醉方法, 确保供体犬在组织采集过程中没有疼痛或者不适感。

A.2.3 组织采集技术：根据目的间充质干细胞来源的不同, 选择合适的组织采集方法, 例如用手术采集皮下脂肪，用手术或从产后废弃器官组织中采集脐带。采集全程遵循无菌原则。

A.2.4 供体犬术后护理：术后应对供体犬应进行体温，行为和身体状况等进行监测;伤口需定期清洁和更换包扎，避免犬舔舐或咬伤;遵循适当的疼痛管理计划，包括使用合适的阵痛药物;为供体犬提供干净舒适的环境，清洁的饮水和易消化的食物，以确保其快速恢复和动物福利。

A.3 犬组织运输和交接标准

A.3.1 犬组织运输条件：应将组织置于大小合适的无菌容器中，并使用适当的缓冲溶液保存。运输过程保证组织温度保持在 4℃~8℃,并于 8 h 内将组织样品运送至实验室进行间充质干细

胞分离。

A.3.2 交接标准：制定详细的交接文件，记录犬的身份信息、健康状况、组织类型、采集日期、过程和采集人信息等。

附录 B

(规范性)

细胞存活率检测细胞计数法

B.1 仪器和设备

B.1.1 明视场显微镜。

B.1.2 血球计数板。

B.2 试剂

除特别说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为 18.2 MQ 去离子水。

B.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。

B.2.2 台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液(B.2.1)稀释至 0.4%(质量浓度)。

B.3 检测步骤

B.3.1 细胞悬液制备

收集待检测细胞，用磷酸盐缓冲液(B.2.1)配制细胞悬液，稀释至合适的浓度。每个血球计数板(B.1.2)的 1 mm²的方格中的细胞的数量应为 20 个～50 个细胞。如果高于 200 个细胞，则需要进行稀释。

B.3.2 细胞染色

按 1:1 的体积比将台盼蓝染液(B.2.2)与细胞悬液(B.3.1)混合均匀。

B.3.3 细胞计数

将盖玻片盖在血球计数板(B.1.2)计数槽上，取 10 μL 混合液(B.3.2) 滴在一侧计数室的盖玻片边缘，另取 10 μL 混合液，滴在另一侧计数室的盖玻片边缘，使混合液充满盖玻片和计数板之间，静置 30 s，将计数板置明视场显微镜(B.1.1)下对被染色的细胞和细胞总数分别进行计数。

对 16×25 规格的计数室，按对角线位，取左上、右上、左下、右下 4 个 1 mm²的中格(即100 个小格)计数。对 25×16 规格的计数室，按对角线位，取左上、右上、左下、右下和中央5个中格(即 80 个小格)计数。当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和左线上的细胞(或只计数下方和右方线上的细胞)。

按照步骤 B.3.2～B.3.3 再重复测定一个样品。

B.3.4 细胞存活率计算

B.4 计算与分析

细胞存活率按式(B.1) 进行计算：

X=(M-S)/M×100% … … … … … … … … (B. 1)

式中：

X — 细胞存活率;

M — 细胞总数;

S — 染色的细胞数。

计算两次计数细胞存活率结果的平均值，记为细胞平均存活率。

B.5 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

附录 C

细胞标志蛋白检测流式细胞法

C.1 仪器和设备

C.1.1 流式细胞仪。

C.1.2 水平离心机。

C.1.3 电子天平。

C.2 试剂

本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。

C.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 7.4。

C.2.2 牛血清白蛋白(BSA)：纯度≥98%。

C.2.3 叠氮钠(NaN₃ )。

C.2.4 抗犬 CD29、CD44、 CD90、 CD34、CD45 抗体及同型对照抗体。

注: 若选用人源或鼠源抗体, 应将人源或鼠源抗原序列进行比对, 确定其与犬源抗原序列相似度在 95%以上方可用于鉴定犬间充质干细胞。

C.2.5 按照相应要求使用电子天平(C.1.3)配制流式检测所需的液体：洗涤液、抗体稀释液。

C.3 样品保存

洗涤液和标记后的样品于 2℃~8℃保存。相关抗体遵照说明书保存。

C.4 检测步骤

C.4.1 样品准备

收集细胞，使用水平离心机(C.1.2)300 g 离心 4 min，弃上清。然后用洗涤液清洗一遍，使用水平离心机(C.1.2)300 g 离心4 min，弃上清。

C.4.2 抗体孵育

按照抗体说明书进行稀释使用。抗体孵育结束后用洗涤液清洗两遍，使用水平离心机(C.1.2)300 g 离心 4 min，弃上清。

C.4.3 过滤上机

用洗涤液重悬细胞，然后通过 40 μm 滤网转移到流式管中，按流式细胞仪(C.1.1)应用手册上机检测。

C.4.4 圈门设定原则

首先根据细胞大小和颗粒度设门，圈出目标细胞分群 1，排除死细胞和其他杂细胞，然后根据 Isotype 对照组荧光强度，在分群 1 的基础上画出阳性细胞群 2，排除没有被荧光抗体标记的阴性细胞。抗体 Isotype 作为阴性对照。

C.5 结果分析

得到的检测结果用软件综合分析，具体参考其软件使用说明。

附录 D

诱导 IDO 表达检测 PCR 法

D.1 仪器和设备

D.1.1 核酸含量测定仪。

D.1.2 PCR 扩增仪。

D.1.3 电泳仪。

D.1.4 凝胶成像仪。

D.2 试剂

D.2.1 重组 IFN-γ。

D.2.2 RNA 提取试剂盒。

D.2.3 RNA 逆转录 PCR 试剂盒。

D.2.4 PCR 引物。

D.2.5 Taq DNA 聚合酶。

D.2.6 Ladder 内标。

D.3 检测步骤

D.3.1 IFN-γ 处理

根据附录 B 方法测定，计算犬间充质干细胞悬液活细胞浓度。按(1×105～4×105)细胞/cm²接种，在犬间充质干细胞培养体系中添加 IFN-γ(10 ng/mL～30 ng/mL)，正常培养 12 h～36 h。同时设立未使用 IFN- γ 处理的犬间充质干细胞为对照组，培养同样时间。

D.3.2 犬间充质干细胞总 RNA 提取

根据 RNA 提取试剂盒产品说明书进行，并使用核酸含量测定仪(D.1.1)进行核酸含量测定。

D.3.3 逆转录 PCR

根据 RNA 逆转录 PCR 试剂盒产品说明书，使用 PCR 扩增仪(D.1.2)获得犬间充质干细胞

cDNA。使用犬 IDO1 特异性引物(IDO1F-5 ′-CCCAACTCTAGGGACCCTTC_3′;IDO1-R5 ′-

CAGATCCATGGAGGAAGGAA_3′)在以下反应条件下进行 IDO 基因扩增： 95℃-2 分钟，95℃ -15 秒(40 个循环)，55℃-30 秒(40 个循环)，72℃-30s(40 个循环)。

D.3.4 PCR 产物电泳

根据电泳应用手册进行电泳检测。

D.3.5 凝胶成像

根据凝胶成像仪应用手册，使用电泳仪(D.1.3)，进行电泳检测。

D.4 结果分析

使用凝胶成像仪(D.1.4)进行成像，未使用 IFN-γ 处理的犬间充质干细胞在扩增产物片段大小范围内无明显条带，IFN-γ 刺激后在扩增产物片段大小范围内可见明显条带。

附录 E

抑制 T 细胞增殖检测 CFSE 标记法

E.1 仪器和设备

E.1.1 血球计数板。

E.1.2 显微镜。

E.1.3 水平离心机。

E.1.4 流式细胞仪。

E.2 试剂

E.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。

E.2.2 0.25%EDTA-胰蛋白酶。

E.2.3 台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液(E.2.1)稀释至 0.4%(质量浓度)。

E.2.4 植物凝集素。

E.2.5 淋巴细胞分离液。

E.2.6 抗体(如：anti-CD3 抗体)。

E.2.7 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)染料。

E.3 检测步骤

E.3.1 T 细胞分离及染色

E.3.1.1 T 细胞分离

利用淋巴细胞分离液(E.2.5)，分离犬外单核周血细胞(PBMC)，用适量无菌磷酸盐缓冲液(E.2.1)并使用水平离心机离心(E.1.3)洗涤 2 次。孵育抗体后用适量无菌磷酸盐缓冲液

(E.2.1)并使用水平离心机离心(E.1.3)洗涤 2 次。重悬细胞至细胞浓度为 5×10⁷ 细胞/mL，40 μm 滤网转移到流式管中，按流式细胞仪应用手册上机分选。

E.3.1.2 T 细胞染色

根据附录 B 方法测定，使用血球计数板(E.1.1)及显微镜(E.1.2)计算细胞悬液活细胞浓度。然后进行 CFSE 标记，根据 CFSE 产品说明书进行。

E.3.2 T 细胞与犬间充质干细胞共培养

E.3.2.1 T 细胞增殖

根据附录 B 方法测定，使用血球计数板(E.1.1)及显微镜(E.1.2)计算犬 T 细胞悬液活细胞浓度，按 1×106 细胞/mL 接种培养，并用(2～5)μg/mL 的植物凝集素(E.2.4)刺激 T 细胞增殖，设立未用植物凝集素(E.2.4)刺激的 T 细胞培养作为对照，培养 96 h，用于检测刺激后 T细胞增殖百分比A。

E.3.2.2 犬间充质干细胞抑制 T 细胞增殖

利用 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化犬间充质干细胞并制备成单细胞悬液，根据附录 B 方法测定，计算 T 细胞与犬间充质干细胞悬液活细胞浓度。犬间充质干细胞按 2×10⁵ 细胞 /mL 接种，细胞贴壁后，将 T 细胞按5:1(T 细胞： 犬间充质干细胞)的比例进行共培养，并用(2～5)

pg/mL 的植物凝集素(E.2.4)刺激 T 细胞增殖，培养 96 h，用于检测犬间充质干细胞抑制后 T细胞增殖百分比 C。

E.3.3 T 细胞收集并检测

收集培养后的 T 细胞，用适量无菌磷酸盐缓冲液(E.2.1)并使用水平离心机离心(E.1.3)

洗涤 2 次，通过 40 μm 滤网转移到流式管中，按流式细胞仪(E.1.4)应用手册上机检测。

E.3.4 圈门设定原则

首先根据细胞大小和颗粒度设门，圈出目标细胞分群 1，排除死细胞和其他杂细胞，排除没有被荧光抗体标记的阴性细胞。然后根据未用植物凝集素刺激的 T 细胞的荧光强度，在分群 1的基础上画出 CFSE 母代细胞位置，根据 CFSE 母代细胞位置画出子代细胞群2(即为 T 细胞增殖的百分比)。

E.4 结果分析

得到的检测结果用软件综合分析，具体参考其软件使用说明。并计算犬间充质干细胞对 T增殖的抑制率。抑制率按式(E.1)进行计算：

Y=(A-C)/A×100% … … … … … … … … … … … (E. 1)

Y -- 抑制率;

A -- 单独 T 细胞(刺激)CFSE 子代细胞的百分比;

C -- 与犬间充质干细胞共培养 T 细胞(刺激)CFSE 子代细胞的百分比。

附录 F

抑制 T 细胞分泌 IFN-γ、TNF-α 检测胞内因子染色法

F.1 仪器和设备

F.1.1 血球计数板。

F.1.2 显微镜。

F.1.3 水平离心机。

F.1.4 流式细胞仪。

F.2 试剂

F.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。

F.2.2 0.25%EDTA-胰蛋白酶。

F.2.3 台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液(F.2.1)稀释至 0.4 %(质量浓度)。

F.2.4 佛波酯(PMA)。

F.2.5 淋巴细胞分离液。

F.2.6 抗体(如 anti-IFN-γ 抗体、anti-TNF- α 抗体)。

F.2.7 布雷非德菌素A(BFA)。

F.2.8 离子霉素。

F.2.9 皂苷(Saponin)。

F.2.10 4%多聚甲醛。

F.3 检测步骤

F.3.1 T 细胞分离

利用淋巴细胞分离液(F.2.5)，分离犬外周血 PBMC，用适量无菌磷酸盐缓冲液(F.2.1)

并使用水平离心机离心(F.1.3)洗涤 2 次。待抗体孵育(F.2.6)后用适量无菌磷酸盐缓冲液

(F.2.1)并使用水平离心机离心(F.1.3)洗涤 2 次。重悬细胞至细胞浓度为 5×107 细胞/mL，40 μm 滤网转移到流式管中，按流式细胞仪应用手册上机分选。

F.3.2 T 细胞与犬间充质干细胞共培养

F.3.2.1 T 细胞炎症因子分泌

根据附录 B 方法测定，使用血球计数板(F.1.1)及显微镜(F.1.2)计算 T 细胞悬液活细胞

浓度，按 1×106 细胞/mL 接种培养，培养 48 h。结束培养前 4 h～6h 往培养体系添加 50 ng/mL 佛波酯(F.2.4)、l0 μg/mL 布雷非德菌素 A(F.2.7)和 l μg/mL 离子霉素(F.2.8)，用于检测

IFN-γ 阳性的 T 细胞比例 A1，和 TNF-a 阳性的 T 细胞比例 A2。

F.3.2.2 犬间充质干细胞抑制 T 细胞炎症因子分泌

利用 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化犬间充质干细胞并制备成单细胞悬液，根据附录 B 方法测定，使用血球计数板(F.1.1)及显微镜(F.1.2)计算 T 细胞与犬间充质干细胞悬液活细胞浓度，犬间充质干细胞按 2×l05 细胞/mL 接种，细胞贴壁后，将 T 细胞按5:1(T 细胞：犬间充质干细胞)的比例进行共培养，培养 48 h。结束培养前 4 h～6 h，往培养体系添加 50 ng/mL 佛波酯

(F.2.4)、l0 μg/mL 布雷非德菌素 A(F.2.7)和 l μg/mL 离子霉素(F.2.8)，用于检测犬间充质干细胞抑制后 IFN-γ 阳性的 T 细胞比例 C1， TNF-α 阳性的 T 细胞比例 C2。

F.3.3 T 细胞收集并标记

收集培养后的 T 细胞，用适量无菌磷酸盐缓冲液(F.2.1)并使用水平离心机离心(F.1.3)洗涤 2 次。用 4%多聚甲醛(F.2.10)固定细胞，用适量无菌磷酸盐缓冲液(F.2.1)并使用水平离心机离心(F.1.3)洗涤 1 次。使用 0.1%～0.2%皂苷(F.2.9)处理穿膜，然后孵育 IFN-γ 和 TNF-α 抗体，用适量无菌磷酸盐缓冲液(E.2.1)并使用水平离心机离心(F.1.3)洗涤 1 次。最后通过 40 μm 滤网转移到流式管中，按流式细胞仪应用手册上机检测。

F.3.4 圈门设定原则

首先根据细胞大小和颗粒度设门，圈出目标细胞分群 1，排除死细胞和其他杂细胞，然后根据 Isotype 组荧光强度，在分群 1 的基础上画出 IFN-γ 阳性的细胞群 2 和 TNF-α 阳性的细胞群3，排除没有被荧光抗体标记的阴性细胞。

F.4 结果分析

得到的检测结果用软件综合分析，具体参考其软件使用说明。并计算犬间充质干细胞对 T细胞分泌 IFN-γ、TNF-α 的抑制率。

抑制率按式(F.1)和式(F.2)进行计算：

IFN- γ 抑制率=(A1-C;)/A1 ×l00% (F.l)

A1 --单独 T 细胞的 IFN-γ 阳性率;

C1 --与人间充质干细胞共培养 T 细胞的 IFN- γ 阳性率。

TNF- α 抑制率=(A2-C2)/A2 ×l00% (F.2)

A2 --单独 T 细胞的 TNF-α 阳性率;

C2 -- 与人间充质干细胞共培养 T 细胞的 TNF-α 阳性率。

附录 G

成骨分化检测茜素红 S 染色法

G.1 仪器和设备

G.1.1 血球计数板。

G.1.2 明视场显微镜。

G.1.3 水平离心机。

G.2 试剂

本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T6682 规定的一级水。

G.2.1 磷酸盐缓法液：pH 为 7.4。

G.2.2 0.25% EDTA-胰蛋白酶。

G.2.3 台盼蓝染色：使用时，用磷酸盐缓冲液(G.2.1)稀释至 0.4%(质量浓度)。

G.2.4 成骨诱导液。

G.2.5 茜素红 S 染色试剂盒。

G.3 检测步骤

G.3.1 细胞样品的准备

G.3.1.1 细胞消化

使用水平离心机(G.1.3)离心收集犬间充质干细胞于离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，避免形成气泡或者残细胞团块。

G.3.1.2 细胞计数

根据附录 B 方法测定，使用血球计数板(G.1.1)及明视场显微镜(G.1.2)计算犬间充质干细胞悬液活细胞浓度。

G.3.2 细胞接种并诱导

细胞接种方式、密度及诱导步骤均遵循成骨诱导液产品说明书，诱导 14 d～21d。

G.3.3 钙结节染色

钙结节染色根据茜素红 S 染色试剂盒说明书进行。

G.4 结果分析

显微镜下可见散在橘红色的钙结节。

附录 H

成脂分化检测油红 O 染色法

H.1 仪器和设备

H.1.1 血球计数板。

H.1.2 明视场显微镜。

H.1.3 水平离心机。

H.2 试剂

H.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。

H.2.2 0.25% EDTA-胰蛋白酶。

H.2.3 台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液(H.2.1)稀释至 0.4%(质量浓度)。

H.2.4 成脂诱导液。

H.2.5 油红 O 染色试剂盒。

H.3 检测步骤

H.3.1 细胞样品的准备

H.3.1.1 细胞消化

使用水平离心机(H.1.3)离心收集细胞于离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，避免形成气泡或者残留细胞团块。

H.3.1.2 细胞计数

根据附录 B 方法测定，使用血球计数板(H.1.1)及明视场显微镜(H.1.2)计算犬间充质干细胞悬液活细胞浓度。

H.3.2 细胞接种并诱导

细胞接种方式、密度及诱导步骤均遵循成脂诱导液产品说明书，诱导 14d～21d。

H.3.3 脂滴染色

脂滴染色根据油红 O 染色试剂盒说明书进行。

H.4 结果分析

显微镜下可见细胞中含大小不等橙红色的脂滴。

附录 I

成软骨分化检测阿尔新蓝染色法

I.1 仪器和设备

I.1.1 血球计数板。

I.1.2 明视场显微镜。

I.1.3 水平离心机。

I.2 试剂

I.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。

I.2.2 0.25% EDTA-胰蛋白酶。

I.2.3 台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液(I.2.1)稀释至 0.4%(质量浓度)。

I.2.4 成软骨诱导液。

I.2.5 阿尔新蓝染色试剂盒。

I.3 检测步骤

I.3.1 细胞样品的准备

I.3.1.1 细胞消化

使用水平离心机(I.1.3)离心收集细胞于离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，避免形成气泡或者残留细胞团块。

I.3.1.2 细胞计数

根据附录 B 方法测定，使用血球计数板(I.1.1) 及明视场显微镜(I.1.2) 计算细胞悬液活细胞浓度。

I.3.2 细胞接种并诱导

细胞接种方式、密度及诱导步骤均遵循成软骨诱导液产品说明书，诱导 14 d～21d。

I.3.3 软骨细胞胞外基质染色

软骨细胞胞外基质染色根据阿尔新蓝试剂盒说明书进行。

I.4 结果分析

显微镜下可见被染为深蓝色的软骨细胞胞外基质。

附录 J

成瘤性检测免疫缺陷小鼠检测法

J.1 仪器和设备

J.1.1 血球计数板。

J.1.2 明视场显微镜。

J.1.3 水平离心机

J.2 试剂

J.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。

J.2.2 0.25% EDTA-胰蛋白酶。

J.2.3 台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液(J.2.1)稀释至 0.4%(质量浓度)。

J.3 检测步骤

J.3.1 细胞样品的准备

J.3.1.1 细胞消化

使用水平离心机(J.1.3)离心收集细胞于离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，避免形成气泡或者残留细胞团块。

J.3.1.2 细胞计数

根据附录 A 方法测定，使用血球计数板(J.1.1)及明视场显微镜(J.1.2)计算犬细胞悬液活细胞浓度。