资料介绍
中华人民共和国国家计量检定规程
JJG 537—2006
荧光分光光度计
2006-05-23发布 2006-11-23实施
国家 质量 监督 检验 检疫 总局 发布
荧光分光光度计检定规程
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代替 JJG 537—1988
JJG 538—1988
本规程经国家质量监督检验检疫总局于 2006年 5 月 23 日批准 , 并自2006年 11月 23 日起施行。
归口 单位 : 全国物理化学计量技术委员会
主要起草单位 : 中国计量科学研究院
参加起草单位 : 上海三科仪器有限公司
本规程委托全国物理化学计量技术委员会负责解释
本规程主要起草人 :
曹文祺 (中国计量科学研究院)
何雅娟 (中国计量科学研究院)
参加起草人 :
黄正义 (上海三科仪器有限公司)
何煜 (上海三科仪器有限公司)
目录
1 范围
本规程适用于荧光分光光度计的首次检定、后续检定和使用中的检验。
2 概述
某些物质受到光照射而被激发之后 , 会发射出比照射波长稍长的光 , 这种光称为荧光。荧光强度与该物质的浓度有如下关系 :
F=k′ΦI0 (1-e-εLc)
式中 : F—荧光强度 ;
k′— 仪器常数 ;
I0— 激发光强度 ;
ε—荧光物质的摩尔吸收系数 ;
L—荧光物质液层的厚度 ;
c—荧光物质的浓度 ;
Φ—荧光量子效率。
对于给定物质来说 , 当激发光的波长和强度固定、液层的厚度固定、溶液的浓度较
低时 , 荧光强度与荧光物质的浓度 c有如下简单的关系 :
F=kc
荧光分光光度计 (以下简称仪器) 就是根据上述原理 , 对可发射荧光的物质进行定性、定量测量的分析仪器。
仪器主要由光源系统、激发单色器系统、样品室、发射单色器系统、探测器系统和数据处理系统组成。
仪器的单色器可分为两类 : A类是色散型单色器 ; B类是滤光片单色器。
3 计量性能要求
3.1 波长示值误差与重复性
3.1.1 A类单色器波长示值误差限和波长重复性应符合以下要求 :
波长示值误差限 : 优于 ±2.0 nm;
波长重复性 : ≤1.0 nm。
3.1.2 B类单色器滤光片透光特性
B类单色器配置的玻璃滤光片、干涉滤光片标称值误差应符合以下要求 :
玻璃滤光片 : 标称值 ±10 nm;
干涉滤光片 : 标称值 ±5 nm。
3.2 检出极限
用硫酸奎宁标准溶液检定仪器的检出极限 :
配置 A类单色器的仪器 , 其检出极限为 5× 10-10 g/mL;
配置 B类单色器的仪器 , 其检出极限为 1× 10-8 g/mL。
在一台仪器上同时配置 A、B两类单色器的 , 可参照 B类单色器的指标。
3.3 测量线性
仪器测量结果的线性 γ≥0.995。
对指针式直读电表仪器 , 若配套指示仪表准确度低于 0.5级 , 此项可不检定。
3.4 荧光光谱峰值强度重复性
仪器测量荧光光谱峰值的重复性 ≤1.5%。
3.5 稳定度
3.5.1 在 10 min内零线漂移 ≤0.5%。
3.5.2 荧光强度示值上限在 10 min内的漂移不超过 ±1.5%。
4 通用技术要求
4.1 外观与初步检查
4.1.1 仪器应有下列标志 : 仪器名称、 型号、制造厂名、 标志、 出厂时间和仪器编号。
4.1.2 仪器的各紧固件应紧固良好 , 各调节旋钮、按键和开关均能正常工作。 电缆线的接插件应接触良好 , 外观不应有明显的机械损伤。
4.1.3 仪器的指示仪表应工作正常 , 刻线应清晰、均匀。 指针的宽度不大于刻线的宽度 , 并应与刻线平行。
4.1.4 旋动指示仪表的 “调零” 和 “满度” 旋钮时 , 电表指针应平稳无跳动现象。
4.1.5 仪器配置的滤光片附件不得有灰尘、油污或影响透光性的斑点存在。
4.2 绝缘电阻
仪器在不工作的状态下 , 试验电压 500V 时 , 电源进线与壳体之间的绝缘电阻不小于 20 MΩ。
5 计量器具控制
计量器具控制包括 : 首次检定、后续检定和使用中检验。
5.1 检定条件
5.1.1 环境条件
环境温度 (20±10)℃ , 且相对稳定 ;
相对湿度不大于 85% ;
电源电压 (220±22)V。
5.1.2 检定设备
工作标准荧光池 : 其配套误差不应大于 0.5%。
紫外可见分光光度计 : 波长示值误差 ±1.0 nm。
秒表 : 分度值 0.1 s。
交流电压表 : 150/500V, 准确度 1.0级。
兆欧表 : 试验电压 500V。
配制标准溶液所需的设备及器材见附录 A。
5.1.3 标准物质
5.1.3.1 硫酸奎宁荧光标准物质 : 国家二级标准物质。
5.1.3.2 萘甲醇溶液 : 国家二级标准物质。
5.1.4 工作标准溶液
5.1.4.1 0.05 mol/L硫酸溶液。
5.1.4.2 以 0.05 mol/L硫酸作为溶剂的硫酸奎宁标准溶液 , 其质量浓度分别为 : 1× 10-9 , 1× 10-7 , 4×10-7 , 8×10-7和 1× 10-6 g/mL。
5.2 检定项目
表 1 检定项目表
5.3 检定方法
仪器应平稳地放在工作台上 , 无强光直射在仪器上 ; 仪器周围无强磁场、 电场干扰 ; 无振动 ; 无强气流影响。 检定前仪器应预热 20 min。 配置滤光片的仪器 , 必须安装好滤光片 , 更换滤光片应先切断电源。
5.3.1 外观与初步检查按 4.1 的要求进行。
5.3.2 A类单色器仪器波长示值误差与波长重复性
5.3.2.1 氙灯亮线方法
注 : 氙灯亮线方法 , 一定要依据仪器使用说明 书的方法进行。 以下方法只是测量步骤的一般性描述。
(a) 激发侧单色器波长示值误差与波长重复性
将发射侧单色器置零级位置 , 将漫反射板 (或无荧光的白色滤纸条) 放入样品室 ,仪器的响应时间设置为 “快 ”, 扫描速度设置为 “中 ” 或采用手动方式 , 使用实际可行的最窄狭缝宽度 , 对激发侧单色器在 (350~ 550) nm 的波长范围进行扫描 , 在所得到的谱图上寻找 450.1 nm 附近 的光 谱峰 , 并确 定其 峰值 位置。 连续 测量 三次 , 按公 式(1) 和 (2) 分别计算波长示值误差和重复性。
波长示值误差 :
式中 : λi— 波长测量值 ;
λr— 参考波长值 (氙灯亮线参考波长峰值 : 450.1 nm)。
波长重复性 :
(b) 发射侧单色器波长示值误差与波长重复性
将激发侧单色器置零级位置 , 将漫反射板 (或无荧光的白色滤纸条) 放入样品室 ,仪器的响应时间设置为 “快 ”, 扫描速度设置为 “中 ” 或采用手动方式 , 使用实际可行的最窄狭缝宽度 , 对发射侧单色器 (350~ 550) nm 的波长范围进行扫描 , 在所得到的谱图上寻找 450.1 nm 附近的光谱峰 , 并确定其峰值位置。连续测量三次 , 按公式 (1)和 (2) 分别计算波长示值误差和重复性。
注 : 对一些型号的仪器 , 其发射侧单色器波长示值误差与波长重复性的测量 , 可以用测量汞灯谱线的方法。 具体测量方法见附录 B 或仪器使用说明书。
5.3.2.2 萘峰位置方法
将发射侧波长设定在 331 nm 处 , 将盛有萘甲醇溶液 (1×10-4g/mL) 的荧光池放入样品室 , 仪器的响应时间设置为 “快 ”, 扫描速度设置为 “中 ” 或采用手动方式 , 使用实际可行的狭缝宽度 (1~3) nm, 对激发侧单色器 (240~350) nm 的波长范围进行扫描 , 在所得到的谱图上寻找 290 nm 光谱峰 , 并确定其峰值位置。 连续测量三次 , 按公式 (1) 和 (2) 分别计算波长示值误差和重复性。
(b) 发射侧单色器波长示值误差与波长重复性 :
将激发侧波长设定在 290 nm 处 , 将盛有萘-甲醇溶液 (1× 10-4 g/mL) 的荧光池放
入样品室 , 仪器的响应时间设置为 “快 ”, 扫描速度设置为 “中 ” 或采用手动方式 , 使用的狭缝宽度 (1~3) nm, 对发射侧单色器 (240~400) nm 的波长范围进行扫描 , 在所得到的谱图上 寻找 331 nm 的光 谱峰 , 并确 定其 峰值 位置。 连续 测量 三次 , 按公 式(1) 和 (2) 分别计算波长示值误差和重复性。
5.3.3 单色器滤光片的检定
5.3.3.1 带通型滤光片的透光特性
用紫外可见分光光度计测量被检仪器的滤光片在各波长处的透射比 , 绘制透射比波长特性曲线 (见图 1)。 由曲线求出最大透射比 Tmax对应的波长 λmax和透射比为 Tmax/ 2 时对应的波长 λ1 , λ2 , 则滤光片峰值波长误差 :
Δλ=λ-λmax (3)
式中 : λ— 滤光片峰值波长标称值。
图 1
5.3.3.2 截止型滤光片
截止型滤光片的透射光特性用半高波长表示。测量方法按照 5.3.3.1, 由图 2所示
曲线求出最大透射比 Tmax , Tmax/2所对应的波长 λ3 为半高波长。
图 2
5.3.4 检出极限
用 0.05 mol/L硫酸溶液做空白溶液 , A类单色器选取质量浓度为 1×10-9g/mL, B
类单色器选取质量浓度为 1×10-7g/mL硫酸奎宁标准溶液。灵敏度置最高挡 , 选择适当的狭缝宽度。根据激发波长在 350 nm、发射波长在 450 nm 左右的原则 , 设定两侧的波长或选择滤光片。对空白溶液与标准溶液进行连续交替 11次测量。 如果在测量中 ,有 1次数据确认是由外界干扰或操作引起的粗大误差 , 应将该次数据剔除。
由下式计算每次测量的荧光强度 :
Fi =Fi1 - Fi0 (4)
式中 : Fi1— 标准溶液的荧光强度 ;
Fi0— 空白溶液的荧光强度。
荧光强度测量值的平均值为 :
式中 : n— 测量次数。
检出极限指二倍于标准偏差读数的物质浓度。用符号 DL来表示 ;
式中 : — 11次测量的平均荧光强度 ;
c— 标准溶液的质量浓度 ;
s— 单次测量的标准偏差。
5.3.5 测量线性
用 0.05 mol/L硫酸溶液作空白溶液 , 适当选择灵敏度挡和狭缝 , 依次测量下面表 2中的各质量浓度硫酸奎宁标准溶液。根据激发波长在 350 nm、发射波长在 450 nm 左右的原则 , 设定两侧的波长或选择滤光片。
表 2 硫酸奎宁标准溶液 g/mL
分别对表 2 中 4种质量浓度工作标准溶液与空白溶液进行连续交替三次测量 , 计算每次测量的荧光强度平均值。用最小二乘法对 4种标准溶液的质量浓度和荧光强度测量平均值进行处理 , 得到线性相关系数 γ, 即为测量线性的检定结果 (最小二乘法公式见附录 D)。
5.3.6 光谱峰值强度的重复性
根据激发波长在 350 nm、发射波长在 450 nm 左右的原则 , 设定两侧的波长或选择
滤光片。用 1× 10-7 g/mL 的硫酸奎宁溶液 , 见光 3 min后 , 对发射波长从 365 nm 至500 nm 重复扫描三次或记录仪器示值。
光谱峰值强度的重复性由下式计算 :
式中 : Fi— 光谱峰值强度读数。
5.3.7 稳定度
5.3.7.1 调节灵敏度中等程度。关闭光闸门 , 记录 10 min内的漂移。
5.3.7.2 置激发波长和发射波长为 450 nm。置激发和发射狭缝宽度为 10 nm。 漫反射板放入样品室 , 调节灵敏度 , 使示值为 90% , 见光 3 min后 , 观察 10 min 内示值的变化。
5.3.8 绝缘电阻
仪器的电源插头不接通电源 , 仪器的电源开关置于接通状态 , 用 500V兆欧表在仪器电源输入电路与外壳之间施加 500V直流试验电压 , 稳定 5 s后测量绝缘电阻。
5.3.9 其他
对测量方法没有完全包括在规程范围内的其他类型荧光分光光度计 , 其主要技术指标可参照上述检定方法进行检定。技术要求可参考仪器说明书注明的指标。
5.4 检定结果的处理
5.4.1 以上检定数据均须记录在检定记录纸上 , 其中有关项目应填写完整或注明在检定证书或检定结果通知书上。
5.4.2 经检定符合本规程规定的仪器 , 发给检定证书 (检定证书背 面格 式见 附录 F;不符合本规程规定的仪器 , 发给检定结果通知书 (检定结果通知书背面格式同附录 F,指出不合格项目)。
5.5 检定周期
检定周期为 1年 , 在此期间 , 当条件改变 (例如更换光源灯、光电管等重要维修项目) 或对测量结果有怀疑时 , 都应进行检定。
附录 A
检定用工作标准溶液的配制
A.1 试剂
表 A.1 试剂及标准物质
A.2 设备与器材
使用滴定管、移液管、无分度吸管、容量瓶须经计量部分校正。
表 A.2 设备及规格
A.3 0.05 mol/L硫酸溶液的配制
将 1000mL 的容量瓶中加入适量的二次蒸馏水。用滴定管取浓硫酸 2.7 mL, 注入容量瓶中。用二次蒸馏水稀释至刻度 , 并混合均匀后放置备用。
A.4 硫酸奎宁标准溶液的配制
A.4.1 配制 500 mL 1× 10-5 g/mL硫酸奎宁溶液
将硫酸奎宁固体试剂在干燥器中放置 24 h 以上。 在分析天平上准确称取 5.00 mg的硫酸奎宁标准物质于 500mL容量瓶中。用适量 0.05 mol/L的硫酸溶液溶解之 , 然后用 0.05 mol/L硫酸稀释至刻度线 , 并混合均匀。
A.4.2 配制 250 mL 1× 10-6 g/mL硫酸奎宁溶液
用单标线移液管取 25 mL 1× 10-5 g/mL硫酸奎宁溶液 , 倾入 250 mL容量瓶中加0.05 mol/L硫酸溶液至刻度线 , 并混合均匀。
A.4.3 依此类推配制其他浓度的硫酸奎宁标准溶液。所需标准母液的体积与质量浓度见表 A.3。 为了清楚明了 , 将 1× 10-6 g/mL标准溶液也列入表内。
表 A.3 硫酸奎宁标准溶液配制方法
A.4.4 在深色的玻璃瓶中贮存高浓度的标准溶液。溶液应避光、低温、密封保存。稀标准溶液应现用现配。浓溶液有效期时间为半年。
附录 B
汞灯谱线的测量方法
B.1 发射侧单色器波长示值误差与重复性
将激发单色器置零级位置 , 在样品室内正确安好笔型汞灯。将漫反射板放入样品架上。 响应时间 “快 ”, 扫描速度 “慢 ” 或手动 , 使用实际可行的最窄狭缝宽度。
以汞谱线作参考波长 , 允许从中任选分布均匀的谱线作参考波长。从短波向长波方向对发射单色器扫描。 电表或记录仪表最大读数时的波长为测量值 , 连续测量三次。按式 (B.1) 和 (B.2) 分别计算波长示值误差和重复性。
λr— 汞灯参考波长值。
B.2 汞灯的参考波长
低压汞灯光谱曲线的参考波长及相对近似强度列在表 B.1 中。 高压汞灯也具有表B.1 中的全部谱线。
表 B.1 低压汞灯光谱曲线的参考波长
附录 C
荧光池成套性的测量
选择合适的滤光片 , 荧光池中装入 1× 10-6 g/mL 的硫酸奎宁溶液 , 将荧光池带有标记的一面正对进光方向 , 然后 , 将其中一只放入其他检定项目合格的被检仪器光路中。仪器示值调至 90%处 , 测量其他荧光池 , 记录荧光池间的仪器示值差。
附录 D
最小二乘法计算公式
Y =a+bX
a=Y - bX
Syy 2 -
Sxy = ∑XY - 注 : 表 2 中的 cj 作为 X, 式 (5) 中的 作为Y, 即可进行计算。
附录 E
荧光分光光度计检定记录格式
1 外观与初步检查
2 波长示值误差与波长重复性
2.1 激发单色器
2.2 发射单色器
3 滤光片透光特性
4 检出极限
F= s= DL= g/mL
5 线性
6 稳定度
7 重复性
8 绝缘电阻
R= MΩ
附录 F
检定证书背面格式
