GB/T 37746-2019 草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法

　　ICS 65 . 020 . 30 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 37746—2019

　　草鱼呼肠孤病毒三重 RT-PCR检测方法

　　TriplexRT-PCR assayfordetectionofgrasscarpreoviruses

　　2019-06-04 发布 2020-01-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 37746—2019

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

　　本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC 156)归口 。

　　本标准起草单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所。

　　本标准主要起草人：曾伟伟、王庆、吴淑勤、王英英、石存斌、宋新建、李莹莹、赵长臣。

　　GB/T 37746—2019

　　引 言

　　本文件的发布机构提请注意如下事实，声明符合本文件时，可能涉及到第 7 章“操作步骤”和附录 B“引物”与《用于诊断草鱼呼肠孤病毒的三重 PCR检测引物组、试剂盒及方法》(专利号：ZL 201210039379 . 8)等相关专利的使用。

　　本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

　　该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。 该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。 相关信息可以通过以下联系方式获得：

　　专利持有人：中国水产科学研究院珠江水产研究所

　　地址：广州市荔湾区西里兴渔路 1 号珠江水产研究所

　　请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　GB/T 37746—2019

　　草鱼呼肠孤病毒三重 RT-PCR检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了 3 种不同基因型草鱼呼肠孤病毒的三重 RT-PCR检测技术。

　　本标准适用于对草鱼的 3 种基因型呼肠孤病毒的核酸进行检测与分离株的鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范

　　3 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　DEPC：焦炭酸二乙酯(diethypyrocarbonate)

　　dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-riboncleoside triphosphate)

　　EB：溴化乙锭(ethidium bromide)

　　GCRV：草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus)

　　M-MLV RT：莫 洛 尼 氏 鼠 白 血 病 病 毒 逆 转 录 酶 (moloney murine leukemia virus reverse tran- scriptase)

　　PBS：磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer solution)

　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　RNA：核糖核酸(ribonucleic acid)

　　RNase inhibitor: RNA酶抑制剂

　　RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应(reverse-transcription polymerase chain action)

　　Taq DNA polymerase：Taq DNA 聚合酶

　　三重 RT-PCR：三重逆转录-聚合酶链式反应 (triplex reverse transcriptase polymerase chain reac-

　　tion)

　　4 技术原理

　　草鱼呼肠孤病毒(GCRV)现有 Ⅰ 、Ⅱ 和 Ⅲ型 3 个基因型，根据同一基因型不同毒株之间共有的保守序列分别设计特异性引物，这些引物可以特异性扩增相对应基因型分离株的核酸，而不能扩增其他基因型分离株的核酸。 在同一聚合酶链式反应(PCR)反应体系里加入针对 3 个基因型的 3 对保守引物，便可同时扩增出 3 个大小有差异的核酸片段，可以通过琼脂糖凝胶电泳的电泳条带分子量大小来区分，从而达到特异性检测和鉴别不同基因型 GCRV 的 目的。

　　GB/T 37746—2019

　　5 试剂和材料

　　5 . 1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格，核酸抽提和 RT-PCR须使用无 RNA酶的去离子水。

　　5 . 2 TRIzol RNA 提取试剂或其他商品化的基因组 RNA提取试剂盒。

　　5 . 3 氯仿 。

　　5 . 4 异丙醇：-20 ℃预冷。

　　5 . 5 无水乙醇。

　　5 . 6 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和 DEPC水配制，-20 ℃预冷。

　　5.7 M-MLV逆转录酶(5 U/μL) : -20 ℃保存。

　　5.8 dNTPs：含 dCTP、dATP、dGTP、dTTP各 10 mmol/μL。

　　5.9 RNA酶抑制剂(RNasin, 40 U/μL) : -20 ℃保存。

　　5. 10 Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) : -20 ℃保存。

　　5. 1 1 DNA分子量标准 DL1000 , 100 bp。

　　5 . 12 1 . 5%琼脂糖凝胶：按附录 A 中 A. 1 配制。

　　5. 13 50 × TAE缓冲液：按 A.2 配制。

　　5. 14 溴化乙锭(EB, 10 μg/μL)：按 A.3 配制。

　　5 . 15 焦炭酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水：按 A. 4 配制。

　　5 . 16 PBS(磷酸盐缓冲溶液)：按 A. 5 配制。

　　5. 17 引物：逆转录引物按附录 B 中的 B. 1,引物浓度为 25 pmol/μL; PCR 引物按 B. 2,引物浓度为25 pmol/μL。

　　5 . 18 阳性对照：将 3 种基因型的 GCRV分别接种草鱼性腺细胞(CO) 或草鱼吻端成纤维细胞(PSF) ,将获得的病毒液等量混合作为阳性对照。

　　5 . 19 阴性对照：以 CO 或 PSF 细胞液作为阴性对照。

　　6 器材和设备

　　6 . 1 PCR扩增仪。

　　6 . 2 高速台式冷冻离心机。

　　6 . 3 掌上离心机。

　　6 . 4 混匀器。

　　6.5 冰箱(2 ℃ ~8 ℃、-20 ℃和-70 ℃的三种)。

　　6 . 6 水浴锅。

　　6 . 7 电泳仪。

　　6 . 8 电泳槽。

　　6 . 9 紫外观察灯或(和)凝胶成像系统。

　　6 . 10 研钵、剪刀和镊子。

　　6. 1 1 微量移液器(2.5 μL, 10 μL, 100 μL, 200 μL, 1 000 μL) 和配套无 RNA酶的吸头。

　　6. 12 0.2 mL PCR管，1. 5 mL 和 0.5 mL 无 RNA酶的 Eppendorf管。

　　GB/T 37746—2019

　　7 操作步骤

　　7 . 1 样品采集与处理

　　7 . 1 . 1 样品采集

　　样品采集按 SC/T 7103 的规定进行。 用无菌镊子和剪刀采集待检鱼脾脏和肾脏组织，每种组织采

　　集的量为 100 mg~300 mg,如脏器不足 100 mg 则采集整个脏器，将采集的组织分别放入 1 . 5 mL 无RNA酶的 Eppendorf管中，编号。

　　7 . 1 . 2 样品贮运

　　样品采集后，放入密闭容器中，于保温箱中加冰或其他冷冻剂，密封，尽快送检。

　　7 . 1 . 3 样品处理

　　将样品置于研磨器中，按质量体积比 1 ∶ 1 加入灭菌 PBS,然后加入液氮或石英砂进行充分研磨;

　　4 ℃ , 3 000 r/min离心 15 min,取上清液转入无菌的 1.5 mL无 RNA酶的 Eppendorf管中，编号备用。

　　7 . 2 RNA提取

　　7.2. 1 取灭菌的 1.5 mL无 RNA酶的 Eppendorf管，编号。

　　7 . 2 . 2 用 TRIzol 试剂提取待检样品、阴性对照及阳性对照样品的 RNA。

　　7.2.3 100 μL 7.1.3 中的上清液，900 μL TRIzol 置入 1.5 mL无 RNA酶的 Eppendorf管，振荡 5 次至10 次，静置 5 min。

　　7.2.4 加入 200 μL氯仿，振荡混匀，室温放置 5 min, 4 ℃ 12 000 r/min, 离心 15 min。

　　7 . 2 . 5 吸取上层水相至一新的 1 . 5 mL 无 RNA 酶的 Eppendorf 管中，加入等体积异丙醇( - 20 ℃预冷)，混匀，室温放置 5 min, 4 ℃ 12 000 r/min, 离心 15 min。

　　7 . 2 . 6 弃去上清，加入 1 mL75%乙醇(DEPC水配制)，缓慢颠倒以漂洗沉淀及管壁，4 ℃ 12 000 r/min,离心 15 min。

　　7.2.7 倒去上清，置室温条件下干燥后，加适量(通常为 20 μL~30 μL)DEPC水溶解。

　　7 . 2 . 8 提取的 RNA应尽快进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增。 若需长期保存，应放置- 70 ℃冰箱。

　　7 . 2 . 9 也可以采用质量相当的商品化基因组 RNA 提取试剂盒进行待检样品、阴性和阳性对照样品RNA 的提取，按照试剂盒说明书进行操作。

　　7 . 3 RT-PCR扩增

　　7 . 3 . 1 -步法反应操作步骤

　　7 . 3 . 1 . 1 反应体系混合液的配制

　　在 0.2 mL PCR管或 0.5 mL或 1. 5 mL无 RNA酶的 Eppendorf管(根据样品数量来选择配制混合液的离心管)依次加入表 1 所示的组分和用量。 全部加完后，混匀，掌上离心机瞬时离心或 6 000 r/ min离心 15 s。

　　GB/T 37746—2019

　　表 1 一步法反应中配制 RT-PCR扩增体系的组分和用量

　　7 . 3 . 1 . 2 反应体系混合液分装

　　将 7.3.1.1 配制好的混合液按每个 PCR管 45.0 μL分装至新的 0.2 mL PCR管中，在各设定的 PCR管中分别加入 7 . 2 中制备的 RNA 溶液 5 . 0 μL, 盖紧管盖，掌上离心机瞬时离心或 6 000 r/ min 离心15 s 。

　　7 . 3 . 1 . 3 RT-PCR扩增

　　42 ℃逆转录 30 min; 95 ℃ 预变性 5 min; 94 ℃ 35 s, 56 ℃退火 35 s, 72 ℃延伸 45 s, 35 个循环; 72 ℃延伸 10 min; 4 ℃保存。

　　7 . 3 . 2 两步法反应操作步骤

　　7.3.2. 1 逆转录时取 5. 0 μL 7. 2 中制备的 RNA,加入浓度为 25 pmol/μL 逆转录随机引物 1. 0 μL, 70 ℃水浴 5 min。

　　7 . 3 . 2 . 2 冰浴 2 min,继续加入表 2 所示的组分和用量。

　　GB/T 37746—2019

　　表 2 两步法反应中配制逆转录体系的组分和用量

　　7.3.2.3 37 ℃ 反应 30 min合成 cDNA, 85 ℃ 灭活 5 min后进行 PCR或置 -20 ℃保存。

　　7 . 3 . 2 . 4 PCR扩增体系配制如表 3 所示，全部加完后，混匀，掌上离心机瞬时离心或 6 000 r/ min 离心15 s 。

　　表 3 两步法反应中配制 PCR扩增体系的组分和用量

　　7.3.2.5 将 7 . 3 . 2 . 4 配制好的混合液按每管 45 . 0 μL分装至新的 PCR 管中，在各设定的 PCR 管中分别加入 7.3.2.3 中制备的 cDNA 5.0 μL,盖紧管盖，掌上离心机瞬时离心或 6 000 r/min离心 15 s。

　　7.3.2.6 PCR扩增：95 ℃ 预变性 5 min; 94 ℃ 变性 35 s, 56 ℃退火 35 s, 72 ℃延伸 45 s,循环 35 次; 72 ℃延伸 10 min, 4 ℃ 保存。

　　7 . 4 扩增产物的电泳检测

　　制备 1 . 5%的琼脂糖凝胶板(参见 A. 1) ,取 5 . 0 μL PCR扩增产物和 1 μL商品化的上样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔中。 110 V恒压下电泳 30 min~45 min,在紫外投射仪或凝胶成像系统上观察并拍照记录。

　　GB/T 37746—2019

　　8 结果判断

　　8 . 1 实验结果成立条件

　　GCRV 阳性对照的 PCR产物，经电泳检测后分别在 195 bp、296 bp 和 501 bp 位置同时出现特异性

　　条带，阴性对照 PCR产物电泳检测后没有目的条带，则试验结果有效，否则试验结果无效。

　　8 . 2 结果判定

　　8 . 2 . 1 阳性判定

　　在试验结果成立的前提下，按以下结果进行判定：

　　a) 若样品中 PCR扩增产物电泳后仅在 501 bp 的位置上出现特异性条带，取 PCR 扩增产物测序，同参考序列进行比较(参见附录 C 中 C. 1),序列相似性在 85%或以上，判定为 GCRV Ⅰ 型检测阳性;

　　b ) 若仅在 195 bp 的位置上出现特异性条带，取 PCR 扩增产物测序，同参考序列进行比较(参见C. 2),序列相似性在 85%或以上判定为 GCRV Ⅱ 型检测阳性;

　　c) 若仅在 296 bp 的位置上出现特异性条带，取 PCR 扩增产物测序，同参考序列进行比较(参见C. 3),序列相似性在 85%或以上判定为 GCRVⅢ型检测阳性;

　　d) 若在 195 bp、296 bp 和 501 bp 中的两个或三个位置上出现特异性条带，分别切取特异性条带并回收和纯化目的片段后测序，同参考序列进行比较(参见附录 C),序列相似性都在 85%或以上，则判定为 GCRV 3 个基因型中的两个或三个基因型检测阳性。

　　8 . 2 . 2 阴性判定

　　在试验结果成立的前提下，按以下结果进行判定：

　　a) 若在 195 bp、296 bp 和 501 bp 的位置上均未出现特异性条带，则判定为 GCRV Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ型检测阴性;

　　b ) 若扩增出特异性条带但测序结果和已知 GCRV分离株的参考序列同源性在 85%以下(参见附录 C),则判定为 GCRV Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ型检测阴性。

　　GB/T 37746—2019

　　附 录 A (规范性附录)相关试剂配制

　　A.1 1 . 5%琼脂糖凝胶

　　琼脂糖粉 1 . 5 g

　　1 × TAE 电泳缓冲液 加至 100 mL

　　将琼脂糖粉加入 100 mL TAE 电泳缓冲液(1×) 中，加热融化。 温度降至 60 ℃左右时，加入 5μL核酸染料，均匀铺板，厚度为 3 mm~5 mm。

　　A.2 50 ×TAE 电泳缓冲液

　　A.2. 1 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液(PH 8.0)

　　乙二胺四乙酸二钠 18 . 6 g

　　灭菌双蒸水 80 mL

　　氢氧化钠 调 pH 至 8 . 0

　　灭菌双蒸水 加至 100 mL

　　A.2 . 2 TAE 电泳缓冲液(50 × )

　　羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242 g

　　冰乙酸 57.1 mL

　　0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液(pH 8.0) 100 mL

　　灭菌双蒸水 加至 1 000 mL

　　用时用灭菌双蒸水稀释使用。

　　A.3 溴化乙锭(EB)溶液

　　溴化乙锭 20 mg

　　灭菌双蒸水 加至 20 mL

　　A.4 DEPC水(亦购买可商品化的 DEPC水)

　　灭菌双蒸水 1 000 mL

　　焦碳酸二乙酯(DEPC) 500 μL

　　室温过夜，121 ℃高压灭菌 15 min。

　　A.5 PBS缓冲液

　　灭菌双蒸水 800 mL

　　GB/T 37746—2019

　　NaCl 8 g

　　KCl 0.2 g

　　Na2 HPO4 1.44 g

　　KH2 PO4 0.24 g

　　用 HCl 调节 溶液的 pH 值至 7 . 4,加灭菌双蒸水定容至 1 L,在 121 ℃高压下蒸气灭菌 20 min。 保存于室温。

　　GB/T 37746—2019

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　引 物

　　B.1 逆转录引物(随机引物)

　　5 -NNNNNNNNN-3′ ( N=A/ T/ C/ G)

　　B.2 PCR引物

　　引物信息见表 B. 1 。

　　表 B.1 PCR引物信息

　　GB/T 37746—2019

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　扩增片段参考序列

　　C.1 Ⅰ 型 GCRV扩增的序列

　　ATTTACCCCCACCTCTGACATGACATCCACCGCCGCCCCGGCCATTGACCTCAAACCTGG GGTTCTCAATCCTACCGGTAAGCTATGGCGACCCGTCGGTACCTCTGTTGCTACCATCGAC

　　TCACTTGCCATCGTTAGCGATCGTTTTGGTCAGTATTCATTTGTCAATGAAGGCATGCGAG AGACCTTTTCAAAAGCGCTCTTCGACATCAACATGTGGCAACCTTTATTCCAAGCGACAAA GACTGGCTGCGGACCGATTGTACTCTCCTCCTTCACAACCACCACCTCCGGTTATGTTGGCG CCACTGCCGGTGATGCCCTTGACAACCCTGTAACGAATGGCGTTTTCATCAGTACTGTGCA AATCATGAACCTTCAGCGGACCATCGCTGCCCGCATGCGTGACGTCGCTCTCTGGCAGAAAC ACTTAGACACCGCCATGACCATGCTAACACCTGACATTTCTGCCGGTAGCGCCTCCTGCAAC TGGAAGAGCTT

　　C.2 Ⅱ 型 GCRV扩增的序列

　　GCTGATGCTGCAGACGGCTAAACCACTTAGTGCGGAGATCACCGCCGCAGATATTCAA GCTATCACACCTCTTGTAGTAGGGACTGATAAGCTCAACACTTTGGTCACCACTGGTTTTG GCAATATTCGCAACATTACCGACTTCTCAATGTCTGCAATTTGGGAACCAGAGACAGTCAG CGCAGCAGGCAATTA

　　C.3 Ⅲ型 GCRV扩增的序列

　　GGCGGCATGAATATGTATCGACTTAATTGGAGAGACGCTTTACGCCGGAAGATCAGA GTCGACAGACAACGTGGTATTATCACCCAGCCAGAGGAGAATGATTGCCTACAAGCGGTA

　　GATGACTACGCTCGTGACTGTGCAGCATTGCTTGATGACGTGTTAGCGCGACAGACGGCGT TTAACCGAGCTAACCCTGGAGGTGAAACGATGCGGGTTAAGCCATTTGCGCAAGCCGATTA CCGTAACCCGTTCGAGTTCGTTCCAGCGATGATATCCCTGACCCGCGTAATCACATA