GB/T 36840-2018 玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36840—2018

　　玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法

　　Detectionandidentificationof

　　clavibactermichiganensissubsp.nebraskensis

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36840—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：高文娜、郑春生、骆卫峰、赵文军、易建平、张丽杰、边勇。

　　GB/T 36840—2018

　　玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了玉米内州萎蔫病菌(cla℃ibactermichiganensissubsp. nebraskensis)检疫鉴定方法。

　　本标准适用于玉米种子和玉米植株材料中的玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法

　　3 基本信息

　　中文名：玉米内州萎蔫病菌

　　学名：cla℃ibactermichiganensis subsp. nebraskensis (Vidaver & Mandel 1974) Davis et al. 1984

　　简称：CMN

　　英文名：Goss’s wilt, Goss’s wilt of maize, Goss ’s bacterial wilt and leaf blight, blight of maize,

　　leaf freckles of maize , wilt of maize , Nebraska leaf freckles and wilt , leaf freckles and wilt

　　分类地位：属细菌界 Bacteria, 放线菌门 Actinobacteria, 微球菌 目 Micrococcales, 微球菌科 Mi- crobacteriaceae,棒形杆菌属 cla℃ibacter。

　　玉米内州萎蔫病菌的其他信息参见附录 A。

　　4 原理

　　玉米内州萎蔫病菌的症状特征、菌落形态特征、生理生化特性、PCR 反应和致病性测试结果是检测鉴定方法的依据。

　　5 主要试剂与设备

　　5 . 1 主要试剂

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。

　　氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、甲醇、乙醇、牛肉浸膏、聚蛋白陈、酵母提取物、蔗糖、琼脂、葡萄糖。

　　培养基和缓冲液配方见附录 B。

　　5 . 2 仪器设备

　　显微镜、超净台、电子天平、高压灭菌锅、冰箱、移液器、离心机、培养箱、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统、实时荧光 PCR仪、Biolog鉴定仪等。

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　　6 检测鉴定

　　6 . 1 现场检疫

　　按照 SN/T 2122 规定的方法进行现场检疫并抽取样品。

　　6 . 2 实验室检测

　　6 . 2 . 1 样品前处理

　　6 . 2 . 1 . 1 种子样品

　　取 100 g种子样品放入三角瓶，加入 200 mL 磷酸缓冲液(PBS缓冲液)(pH 7 . 2) , 4 ℃浸泡过夜;滤纸过滤后取浸泡液，10 000 r/min离心 10 min, 1 mL PBS悬浮沉淀，12 000 r/min 离心 5 min, 弃上清

　　液，沉淀用 DNA提取试剂盒提取 DNA。 样品如有种衣剂处理，先用 自来水浸泡并洗去种衣剂。 可用纱布包裹搓洗数次。

　　6 . 2 . 1 . 2 植物材料

　　有症叶片取病健交界处 2 mm×2 mm组织，置于载玻片上，加__滴无菌水，加盖玻片，置于显微镜下观察喷菌现象。 如观察到喷菌现象，剪取 5 块 ~ 10 块症状组织，每块 10 mm× 10 mm,剪碎后加入1 mL生理盐水，室温浸泡 1 h,取浸泡液 12 000 r/min离心 5 min, 1 mL灭菌水悬浮沉淀;沉淀悬浮液离心后沉淀提取 DNA。

　　6 . 2 . 2 PCR初检

　　样品 DNA分别取 1 μL用于常规 PCR或实时荧光 PCR检测(见附录 C 和附录 D),重复 3 次 。

　　6 . 2 . 3 病原菌分离

　　6 . 2 . 3 . 1 种子样品

　　若 PCR检测为阳性，另取种子样品 100 g,0 . 5%次氯酸钠表面消毒 10 min, 灭菌水洗三次，加入200 mL PBS缓冲液(pH 7.4) , 4 ℃浸泡过夜;120 r/min振荡 15 min~30 min,灭菌滤纸或纱布(4 层 ~ 8 层)过滤，滤液室温静置 15 min, 取上清液，10 000 r/ min 离心 15 min, 1 mL 灭菌水悬浮沉淀。 取

　　100 μL悬浮液系列稀释 10 倍、100 倍和 1 000 倍，悬浮液及稀释液分别取 100 μL涂布 sCNS平板，每个处理涂布 5 个 ~10 个平板，28 ℃培养 5 d~7 d后检查菌落生长情况。 如发现疑似菌落，纯化 3 次后用于后续试验。

　　6 . 2 . 3 . 2 植物材料

　　若 PCR检测为阳性，从症状组织的四个方向切取 4 个小块组织，每块均从病健交界处取 5 mm× 5 mm,70%乙醇表面消毒 15 s,无菌水洗三次后用无菌剪刀剪碎，置于无菌培养皿中，加 200 μL 生理盐水，室温浸泡 1 h,取浸泡液在 NA培养基平板上划线分离，划线 5 个 ~10 个平板，27 ℃ 培养 3 d~5 d。

　　6 . 2 . 4 鉴定试验

　　6 . 2 . 4 . 1 菌落形态特征

　　NA 和 sCNS平板上 25 ℃培养 6 d后，典型菌落淡黄色或杏橙色，圆形，扁平，或稍凸起，边缘光滑，有光泽。 挑取可疑菌落在 NA培养基平板上纯化三次后进行鉴定。

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　　6 . 2 . 4 . 2 PCR检测

　　分离物菌落纯化后，菌体提取 DNA后进行 PCR检测或实时荧光 PCR 检测，检测程序见附录 C 和附录 D。 PCR检测阳性的分离物进行后续测试。

　　6.2.4.3 Biolog测试

　　分离物在 NA上培养后转移至 BUG培养基(见附录 B) 上，33 ℃培养 24 h,按照 Biolog使用说明，调整分离物菌悬液浊度加入 Biolog GN微孔板或 GⅢ微孔板中，每孔 100 μL。 微孔板 33 ℃培养 18 h后用 Biolog仪读数，获得测试结果。

　　6 . 2 . 4 . 4 烟草过敏性反应

　　分离物在 NA 上 28 ℃培养 48 h~72 h后用无菌水配成 108 CFU/ mL 的菌悬液，采用组织渗透法接种普通烟叶背面，以无菌水作为对照，28 ℃光照培养 24 h~48 h后观察是否产生过敏性反应。

　　6 . 2 . 4 . 5 致病性测试

　　分离物 108 CFU/mL菌悬液针刺接种玉米幼叶，进行致病性测试。 选取健康甜玉米种子种植，在生出 2 片幼叶后，针刺小孔，接种菌悬浮液，保湿 1 d,室温下生长。 接种 7 d~10 d后观察接种点附近出现症状。 根据柯赫氏法则，对发病子叶再分离病原菌，分离的病菌用 PCR 进行检测，完成了整个测试程序。

　　7 结果判定

　　分离物的菌落形态特征与 CMN相符，Biolog测试为 CMN, PCR检测结果为阳性，烟草过敏性反应为阳性，致病性测试出现典型症状，判定为 CMN。

　　8 样品保存

　　阳性种子样品至少保存 6 个月，至少 1 000 粒，以备复核、谈判和仲裁;阳性的植物材料及时销毁处理;分离菌株应妥善保存，将菌株转接到 NA试管斜面上，28 ℃培养 48 h。 然后置于 4 ℃冰箱中保存，定期(30 d)转接;或在菌悬液中加入 15%~30%甘油于- 80 ℃下保存;必要时可将菌株冻干，- 80 ℃下长期保存。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　玉米内州萎蔫病菌相关资料

　　A.1 形态特征

　　玉米内州萎蔫病菌属革兰氏染色阳性，大小约为(0 . 6 μm~0 . 7 μm) × (0 . 7 μm~1 . 2 μm),大部分为楔形细胞，也存在球状细胞，直或弯的杆状细胞。 好氧，不抗酸，不产芽孢，无鞭毛，最适生长温度为

　　26 ℃ ~27 ℃ ,最高生长温度 37 ℃ ~38 ℃。

　　A.2 地理分布

　　美国(科罗拉多州、伊利诺斯州、印第安纳州、爱荷华州、堪萨斯州、路易斯安那州、密歇根州、明尼苏达州、密苏里州、内布拉斯加州、北达科他州、南达科他州、得克萨斯州、威斯康星州和怀俄明州)，加拿大(阿尔伯塔、马尼托巴和安大略)。

　　A.3 寄主植物

　　主要 寄 主 是 玉 米 zea mays。接 种 能 侵 染 假 蜀 黍 Echlaena mexicana，甘 蔗 saccharum oficinarum，高粱 sorghum bicolor，苏丹草 s.sudanense，鸭茅状摩擦禾 Tripsacum dactyloides。

　　A.4 传播途径

　　病菌可以侵染玉米植株的任何部位，在玉米叶、茎杆、穗轴和穗等病残体上越冬，存活期长达 10 个月 。种子的自然侵染率可达 20 . 8%。 病菌侵染主要经由伤口侵入。 近距离传播主要依靠雨水或灌溉水，远距离传播主要靠种子，种子内外均可带菌，种子中病菌至少存活 1 年，该病害是典型的种传植物细菌病害。

　　A.5 为害症状

　　症状表现为叶片萎蔫和系统枯萎两种类型。 该病在叶片上最初为不连续的水渍状斑点，初为暗绿色至黑色，后变褐色，与叶脉平行(参见图 A. 1),表面常有细菌溢脓。 系统侵染时，维管束变色，根和近地面的茎秆干腐或水渍状褐腐。 玉米幼苗和成株均可发病。 细菌通过伤口侵染，也可直接通过叶片侵染或者细嫩植株的根和茎秆系统侵染引起发病。 苗期侵染引起萎蔫、死亡，后期侵染造成植株矮化，叶片上出现灰白色或黄绿色条纹，条纹边缘波浪形或不规则形，有时有黑色斑点，最后干枯。

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　　图 A.1 玉米内州萎蔫病菌侵染造成的叶片萎蔫症状

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　　附 录 B

　　(规范性附录)缓冲液及培养基

　　B.1 缓冲液 A：0. 1 mol/L磷酸钠缓冲液，PH 7.4

　　2.62 g NaH2 PO4 . H2 O ; 14.42 g Na2 HPO4 . 2H2 O ;溶于灭菌水中，调节体积至 1 000 mL。

　　B.2 PBS缓冲液(磷酸缓冲液)，PH 7.4

　　0.01 mol/L缓冲液 A(pH 7.4)80 mL 中加入 0.88 g NaCl,并用 0.01 mol/L缓冲液 A调节体积至100 mL。

　　B.3 NA培养基

　　牛肉浸膏 3 g, 聚蛋白陈 5 g,酵母提取物 10 g,蔗糖 10 g,琼脂 18 g,加无菌水至 1 000 mL, pH 调至

　　7.0~7.2, 高压灭菌 20 min。

　　B.4 SCNS培养基

　　营养肉汤 8 g, 酵母提取物 2 g, K2 HPO4 2.0 g, KH2 PO4 0.5 g, 葡萄糖 15 g, MgSO4 ·7H2 O 0.25 g,琼脂粉 15 g, 百菌清(Bravo 720)0.2 mL 以去离子水 1 ∶ 50 稀释，噻菌灵(Mertect 340F) 50 μL, 重铬酸钾 0.02 g,水定容到 1 000 mL。灭菌后，加入萘啶酮酸钠盐 40 mg(溶于 0.1 mol/L NaOH), 放线菌酮100 mg(溶于 1 mL无水甲醇)。

　　B.5 BUG培养基

　　57 g BUG琼脂粉，加无菌水至 1 000 mL,高压灭菌 20 min。

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　　附 录 C (规范性附录)常规 PCR方法

　　C.1 常规 PCR之 一

　　引 物 为 PSA-7 ( 5′-CCCTTTCCGTCGTCCTTTCG-3′)/PSA-R ( 5′-TACTGAGATGTTTCACT- TCCCC-3′),预期扩增产物分别为 393 bp。

　　C.2 常规 PCR之二

　　引 物 为 1184-F ( 5′-ATGCAATCACCTGACGATGTCGTG-3′)/1184-R ( 5′-TCAGCGACCCA- CATTCAGGTT-3 ),预期扩增产物分别为 390 bp。

　　C.3 PCR反应体系

　　PCR反应体系 25 μL,包括 2.5 μL 10×PCR缓冲液(Mg2+ ) ,2.5 μL dNTP(各 250 μmol/L) , 1 μL上下游引物(引物浓度各为 10 nmol/L) , 1 μL模板 DNA, 1.5 U Taq聚合酶(5 U/μL),加水至 25 μL。

　　以灭菌去离子水作空白对照，以 CMN 的 DNA作为阳性对照，重复 3 次 。

　　C.4 反应程序

　　PCR反应程序：94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 循环 30 次 ~ 40 次;最后 72 ℃

　　10 min 。

　　扩增产物用 1 . 5%琼脂糖凝胶 1×TAE缓冲液电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。

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　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　实时荧光 PCR方法

　　D.1 引物及探针之 一

　　引物 FP ( 5′-TGTCGAGGGCATGTTGCACG-3′)/RP ( 5′-GGAGACAGAATTGACCAATGAT- 3′) ,探针 Cmn (FAM-5′-TTCCGTCGTCCTTTCGTGGATG-3′-TAMRA)。

　　D.2 引物及探针之二

　　引物 cmn3F ( 5′-AGTTACTGGTGAATGTGAGCACG-3′)/cmn110R ( 5′-GTGATGGCTGGGC- CGCC-3 ) ,探针 cmn38pb(Cy5-5′-AGCCTGAGTTCCCGCGACGTT-3′-BHQ2)。

　　D.3 扩增条件

　　反应总体积为 20 L,包括：实时荧光反应混合液(TaqMan Master Mix) 10 L, 10 mol/L 的上下游引

　　物各 1 L, 10 mol/ L 的探针 1 L, DNA 1 L。 以灭菌去离子水作空白对照，以 CMN 的 DNA作为阳性对照，重复 3 次 。

　　D.4 结果判定

　　阳性对照和空白对照均正常扩增，样品扩增曲线呈典型的 S形，则：

　　— 检测 Ct值小于或等于 36,判定 CMN 检测结果呈阳性;

　　— 检测 Ct值等于 40,判定 CMN 检测结果呈阴性;

　　— 检测 Ct值在 36~40 之间，再次检测;检测结果如果 Ct值小于或等于 36 则判定 CMN 检测结果呈阳性;如果 Ct值等于 40 则判定 CMN 检测结果呈阴性;如果 Ct值仍在 36~40 之间，可将产物进行测序分析。

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　　参 考 文 献

　　[1] Bach H J , Jessen I, Schloter M, Munch J C, 2003. A TaqMan-PCR protocol for quantifica- tion and differentiation of the phytopathogenic Clavibacter michiganensis subspecies. Journal of Micro- biological Methods. 52 : 85-91.

　　[2] McNally R R, Ishimaru C A, Malvick D K. , 2016. PCR-Mediated Detection and Quantifica- tion of the Goss ’s Wilt Pathogen Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis Via a Novel Gene Target. Phytopathology. 106(12) : 1465-1472.

　　[3] Pastrik, K. H. , & Rainey, F. A. , 1999. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subsp . michignensis by polymerase chain reaction-based techniques . Journal of Phytopa- thology, 147 , 687-693.

　　[4] Tambong JT, Xu R, Daayf F, Brière S, Bilodeau GJ , Tropiano R, Hartke A, Reid LM, Cott M, Cote T, Agarkova I. 2016. Genome Analysis and Development of a Multiplex TaqMan Real- Time PCR for Specific Identification and Detection of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis. Phytopathology. 106(12) : 1473-1485.