GB/T 36831-2018 松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36831—2018

　　松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofcronartiumfusiformeHedgcock&

　　HuntexCummins

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36831—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：王颖、程颖慧、叶奕优、余道坚、高瑞芳、章桂明、李芳荣、史亚千、李秋枫、刘新娇、封立平、陈吴健。

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　　松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了松纺锤瘤锈病菌(cronartiumfusiformeHedgcock & Hunt ex Cummins) 的检疫鉴

　　定方法。

　　本标准适用于松纺锤瘤锈病菌寄主、转主寄主及其产品中携带松纺锤瘤锈病菌的检疫鉴定。

　　2 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　2.1

　　性孢子器 pycnia

　　由担孢子萌发形成的单核菌丝体在侵染寄主时形成的锈菌性器官。

　　2.2

　　性孢子 pycniospore

　　性孢子器中产生的单核孢子。

　　2.3

　　锈孢子器 aecia

　　由性孢子与受精丝结合或与单核菌丝结合产生的双核次生菌丝组织。

　　2.4

　　锈孢子 aeciospore

　　锈孢子器中产生的串生、单胞、双核、黄色、球形或卵形的孢子。

　　2.5

　　夏孢子堆 uredinium

　　由双核菌丝产生的成堆的黄色或橙黄色的双核孢子。

　　2.6

　　夏孢子 urediniospore

　　夏孢子堆内产生的单胞、双核表面有细刺或疣刺的无性孢子。

　　2.7

　　冬孢子 teliospore

　　由双核菌丝产生的厚壁有性孢子在生长后期形成的单胞或多胞的休眠孢子。

　　2.8

　　冬孢子堆 telia

　　冬孢子聚集在一起形成的组织。

　　2.9

　　担子 basidia

　　寄主体上的冬孢子萌发形成的组织。

　　2 . 10

　　担孢子 basidiospore

　　担子横裂四胞，每胞生一小柄，其上着生单胞、无色或稍带黄色的孢子。

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　　3 基本信息

　　中文名：松纺锤瘤锈病菌

　　英文名：Southern fusiform rust

　　学名：Cronartiumfusiforme Hedgcock & Hunt ex Cummins

　　无性态：peridermiumfusiformeJ.C. Arthur & Kern.

　　分类地位：真菌界 Fungi, 担子菌门 Basidiomycota,柄锈菌亚门 Puccniomycotina,柄锈菌纲 Puccin- iomycetes, 柄锈菌目 Pucciniales, 柱锈菌科 Cronartiaceae, 柱锈属 Cronartium。

　　传播途径：松纺锤瘤锈病菌主要通过气流及感病寄主传播。

　　近似种：油松疱锈病菌 Cronartium coleosporioides，北美松疱锈病菌 C.comandrae，香蕨柱锈菌

　　C.comptoniae，苏格兰松疱锈病菌 C.flaccidum。

　　松纺锤瘤锈病菌的其他信息参见附录 A~附录 C。

　　4 方法原理

　　松疱锈病菌的形态学特征及 ITS1/ITS4 核酸序列比对结果作为检疫鉴定该病菌的主要依据，同时参考病原菌的发生国家和地区、寄主范围及为害症状。

　　5 仪器用具和主要试剂

　　5 . 1 仪器用具

　　高压灭菌锅、显微镜、体视显微镜、冰箱、PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅、样品袋、标签、放大镜、培养皿、载玻片、盖玻片、手术刀、手术剪、镊子、吸管、酒精灯、滤纸等。

　　5 . 2 主要试剂

　　三羟甲基氨基甲烷乙酸缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙酸、乙醇、引物 ITS1/ ITS4 、PCR 缓冲

　　液、Taq聚合酶、dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、DNA 分子量 Marker 等分子生物学试剂及基因

　　组提取试剂盒。

　　6 检疫鉴定

　　6 . 1 症状检查

　　观察松属寄主植物：

　　a) 主干和枝条上是否有圆形、纺锤形或不规则的肿瘤，肿瘤表面皮层不规则破裂，且破裂处当年生出新皮层，来年再破裂，皮层完全脱落后，露出浸透松脂的木质部，颜色较深，犹如灼伤;

　　b ) 肿瘤上部枝条或树干日久便枯死或风折，检查在肿瘤裂缝处是否有桔黄色蜜滴溢出，其中混有性孢子;

　　c) 肿瘤表皮下是否有黄色疱状孢子器，含有大量的黄色粉状锈孢子;

　　d) 受侵种苗是否出现丛枝。

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　　观察栎属等转主寄主植物的叶片，是否出现叶斑及黄色小点，即夏孢子堆，叶的正面相应部分色泽较健康部分稍淡。 在夏孢子堆中生出许多褐色至暗褐色的毛状物，即冬孢子柱。

　　松纺锤瘤锈病菌及其近似种的症状及病原菌特征比较参见附录 B。

　　将可疑样品带回实验窒作进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期等信息。

　　6 . 2 形态学特征

　　锈孢子器球形至梭形，壁薄，厚度为 2 个 ~3 个细胞，有疣状突起;锈孢子倒卵形至近球形，大小为

　　(22 μm~28 μm) × (13 μm~18 μm),具有粗糙的疣状隆起，高为 1.5 μm~2.5 μm。夏孢子堆着生在叶背面，半球形，偶尔有侧丝，透明至棕色;夏孢子卵形至椭圆形，微黄色，大小为( 17 μm~ 21 μm) ×

　　(12 μm~15 μm) , 夏孢子表面有均匀锐利的小刺，长为 0 . 7 μm~1 . 5 μm。 冬孢子堆着生在叶背面，散开，呈纤维状栗棕色孢子柱;冬孢子圆柱形至梭形，微黄棕色，大小为(35 μm~ 70 μm) × ( 14 μm~ 27 μm) , 壁光滑，有 1 个或 2 个萌芽孔。 松纺锤瘤锈病菌及其近似种的病菌形态鉴定特征参见附录 B和附录 C。

　　6 . 3 核酸序列比对

　　6 . 3 . 1 引物

　　采用 ITS1/ ITS4 进行扩增，引物序列为：

　　ITS1 : 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′

　　ITS4 : 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

　　6 . 3 . 2 DNA提取

　　取病原菌孢子提取 DNA(参见附录 D) 。

　　6 . 3 . 3 PCR反应

　　PCR反应体系总体积 30 μL,包含：缓冲液 3.0 μL; 10 mmol/L dNTP 0.5 μL;Taq聚合酶 2.5 U;引物各 0.5 μL (20 μmol/L);DNA摸板 1 μL。反应程序：94 ℃预变性 2 min; 94 ℃ 1 min, 53 ℃ 1 min, 72 ℃ 延伸 1.5 min, 30 个循环;72 ℃延伸 10 min。

　　扩增产物在 1 . 5%琼脂糖凝胶 1 × TAE 缓冲液中电泳，EB 染色后凝胶成像，如有 目标片段大小的单带出现，扩增产物进行序列测定。

　　将测序获得的序列与 NCBI 网站 GenBank 中相关序列进行同源性比对分析。

　　7 结果判定

　　病害症状符合 6 . 1,而且病菌的形态学特征符合 6 . 2 , ITS 序列比对结果与 6 . 3 描述相符，判定为松纺锤瘤锈病菌。

　　8 样品保存与处理

　　松纺锤瘤锈病的样品或病组织及玻片标本、核酸等需保存至少 6 个月，以备复验、谈判和仲裁。 保

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　　存期满后，样品经高温高压灭菌或其他适当的方式进行除害处理。

　　9 实验室记录保存

　　妥善保存检测报告包括症状、病菌等图文资料。 检测报告注明检测 日期、方法、结果等，并有实验人员和审核人员签名。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　松纺锤瘤锈病菌及其近似种的地理分布和寄主范围

　　A.1 松纺锤瘤锈病菌cronartium fusiforme的地理分布和寄主范围

　　A.1 . 1 地理分布

　　美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、菲律宾、前苏联、比利时、土耳其、德国、印度、西班牙、葡萄牙、英国、巴基斯坦、危地马拉、中国。

　　A.1 . 2 寄主范围

　　寄主：华山松 Pinusarmandii，北美短叶松 P.banksiana，加勒比松 P.caribaea，P.chihuahuana， P.clausa，扭叶松 P.contorta，赤松 P.densiflora，萌芽松 P.echinata，湿地松 P.elliottii，地中海松

　　P.halepensis，P.khasya，P.leiophyllavar. chihuahuana，琉球松 P.luchuensis，马尾松 P.massoni- ana，欧洲山 松 P.mugo，海 岸 松 P.pinaster，长 叶 松 P.palustris，西 黄 松 P.ponderosa，尖 刺 松

　　P.pungens，辐射松 P.radiata，落 叶 松 P.resinosa，刚 松 P.rigida，晚 松 P.serotina，欧 洲 赤 松

　　P.sil℃estris，油松 P.tabulaeformis，火炬松 P.taeda，台湾二叶松 P.tai∞anensis，P.teocote，黑松

　　P.thunbergii，弗吉尼亚松 P.℃irginiana，云南松 P.yunnanensis。

　　转主寄主：尖锐栎 Quercusacuta，麻栎 Q.acutissima，海岸栎 Q.agrifolia，美国白栎 Q.alba，槲栎 Q.aliena，黄北栎 Q.bicolor，Q.borealis，峡谷栎 Q.chrysolepis，胭脂虫栎 Q.coccifera，猩红栎

　　Q.coccinea，波罗栎 Q.dentata，道格拉斯栎Q.douglasii，加州丛栎Q.dumosa，Q.engelmanni，白栎

　　Q.fabri，南美红栎Q.falcata，奥里根白栎Q.garryana，Q.glandulifera，青刚栎Q.glauca，大叶栎

　　Q.griffithii，冬青栎 Q.ilex，鹅卵石橡树 Q.imbricaria，加州黑栎 Q.kelloggii，桂叶栎 Q.laurifo- lia，Q.lusitanica，Q.maccormickii，大果栎Q.macrocarpa，Q.maxima，马利兰德栎Q.marilandica，蒙古 栎 Q.mongolica，山 栎 Q.montana，小 叶 青 冈 Q.myrsinaefolia，Q.neo-stuxbergii，黑 栎

　　Q.nigra，沼生栎Q.palustris，欧洲白栎Q.pedunculata，无梗花栎Q.petraea，柳叶栎Q.phellos，青克平栎指拟冬青叶栎 Q.prinoides，Q.prinus，Q.pumila，Q.reticulata，北美红栎 Q.rubra，高山栎

　　Q.semecarpifolia，袍栎Q.serrata，星毛栎Q.stellata，欧洲漩栎Q.tinctoria，Q.tomentosa，美洲黑栎

　　Q.℃elutina，弗 吉 尼 亚 栎 Q.℃irginiana，Q.to≈≈ae，Q.urticaefolia，栓 皮 栎 Q.℃ariabilis， Q.∞isli≈eni，盐肤木 Rhuschinensis，Castaneabungeana，日本栗 C.crenata，美洲栗 C.dentata，锥栗

　　C.henryi，板栗 C.mollissima，齿栗 C.pumila，欧洲栗 C.sati℃a，尖叶榜 Castanopsiscuspidata，青冈Cyclobalanopsisglauca，日 本 水 青 冈 Fagusjaponica，密 花 石 栎 Lithocarpusdensiflorus，Pasania densiflora。

　　A.2 北美松疱锈病菌cronartium comandrae的地理分布和寄主范围

　　A.2 . 1 地理分布

　　加拿大、美国。

　　A.2 . 2 寄主范围

　　寄主：窄果松 P.attenuata，美国短叶松 P.banksiana，小干松 P.contorta，阔叶小干松 P.contorta

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　　var. latifolia，短叶松 P.echinata，湿地松 P.elliottii，光松 P.glabra，约弗松 P.jeffreyi，欧洲山松P.mugo，欧洲黑松 P.nigra，海岸松 P.pinaster，美国黄松 P.ponderosa，刺针松 P.pungens，美加红松 P.resinosa，刚松 P.rigida，晚松 P.serotina，欧洲赤松 P.sylyestris，火炬松 P.taeda，北美二针松P.℃irginiana。

　　转主寄主：comandraumbellata，Geocaulonli℃idum。

　　A.3 香蕨柱锈菌cronartium comptoniae的地理分布和寄主范围

　　A.3 . 1 地理分布 加拿大、美国。

　　A.3 . 2 寄主范围

　　寄主：美国短叶松 P.banksiana，小干松 P.contorta，短叶松 P.echinata，欧洲山松 P.mugo，美国黄松 P.ponderosa，美加红松 P.resinosa，刚松 P.rigida，欧洲赤松 P.syl℃estris，大果松 P.coul- teri，赤松 P.densiflora，约弗松 P.jefreyi，粗糙松 P.muricata，欧洲黑松 P.nigra，海岸松 P.pi- naster，刺针松 P.pungens，辐射松 P.radiata，火炬松 P.taeda，北美二针松 P.℃irginiana等。

　　转主寄主：甜蕨 comptoniaperegrina，甜香杨梅 Myricagale等。

　　A.4 油松疱锈病菌cronartium coleosporioides的地理分布和寄主范围

　　A.4 . 1 地理分布

　　哥斯达黎加、危地马拉、加拿大、墨西哥、美国。

　　A.4 . 2 寄主范围

　　寄主：美国短叶松 P.banksiana，小干松 P.contorta，阔叶小干松 P.contorta var. latifolia，P. contortavar. murrayana，大果松 P.coulteri，恩氏松 P.engelmannii，约弗松 P.jefreyi，山松 P. montezumae，P.ponderosavar. scopulorum 等。

　　转主寄主：火焰草属 castilleja sp. , 玄参科 scrophulariaceae。

　　A.5 苏格兰松疱锈病菌cronartium flaccidum 的地理分布和寄主范围

　　A.5 . 1 地理分布

　　美国、葡萄牙、西班牙、英国、保加利亚、前苏联、芬兰、挪威、乌克兰、瑞典、丹麦、日本、中国、波兰、韩国、比利时、德国、罗马尼亚、法国、意大利、奥地利、瑞士。

　　A.5 . 2 寄主范围

　　寄主：欧洲赤松 P.syl℃estris、海岸松 P.pinaster、意大利伞松 P.pinea、地中海松 P.halepensis、油松 P.tabuliformis、赤松 P.densiflora等。

　　转主寄主：马利筋属 Asclepiasspp.、凤仙花属 Impatiensspp. 、芍药属 Paeonia spp.等。

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　松纺锤瘤锈病菌及其近似种的症状及病原菌特征

　　松纺锤瘤锈病菌及其近似种的症状及病原菌特征见表 B. 1 。

　　表 B.1 松纺锤瘤锈病菌及其近似种的症状及病原菌特征

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　松纺锤瘤锈病症状及病原菌形态特征图

　　松纺锤瘤锈病症状及病原菌形态特征图见图 C. 1 。

　　注 1 : a) ~f)松纺锤瘤锈病在松属植物上的症状;g) ~h)栎属植物上的夏孢子堆;i)栎属植物上的冬孢子柱;j) ~k)

　　锈孢子。

　　注 2 : a) ~c) 引 自 Clemson University;e) 引 自 USDA Forest Service;d)、f) ~i) 引 自 Robert L. Anderson;j) ~k) 电镜照片引 自 A A Antonopoulos。

　　注 3 : j)放大倍数为 5 400;k)放大倍数 2 250 。

　　图 C.1 松纺锤瘤病症状及病原菌形态特征图

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　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　DNA提取方法

　　DNA提取方法如下：

　　a ) 将盖玻片切割成 1 mm×1 mm 的小块，75%乙醇浸泡 1 h,去离子水冲洗 3 遍，湿热灭菌备用;

　　b ) 在解剖镜下挑取 5 个 ~100 个锈菌孢子，置于上述玻片上，此上加盖另一玻片，用镊子轻压，直至看见孢子压裂;

　　c) 取 Genomiphi裂解缓冲液 3 μL 于 PCR 管中，将上述两片玻片同时移入加了裂解缓冲液的PCR管中，65 ℃温浴 10 min;

　　d) 加入 1 μL 中和缓冲液终止反应;

　　e) 加入 1 μL酶、4 μL无菌水、11 μL反应缓冲液、1 μL扩增混合液，30 ℃温育 2 h ;

　　f) 65 ℃温浴 10 min;

　　g) 加 20 μL TE溶解 DNA。

　　该核酸制备也可采用各实验室建立的方法。

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　　参 考 文 献

　　[1] http://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/index.cfm

　　[2] EPPO quarantine pest. Cronartium fusiforme, Prepared by CABI and EPPO for the EU un- der Contract 90/399003 .

　　[3] C. M. I. 1977. Cronartium fusiforme. Distribution Maps of Plant Diseases, No. 475 : 1-2. (edition 2) . CAB International, Wallingford, UK.

　　[4] A A Antonopoulos, R. L. Chapman, 1976. Morphology of Cronartium fusiforme Aecios- pores : A Light and Scanning Electron Microscopic Study, Botanical Gazette, 137(3) : 285-289.

　　[5] Cannon, P.F.2007.Cronartium quercuum. IMI Descriptions of Fungi and Bacteria No. 1724. CAB International, Europe, Egham, UK.

　　[6] I.M.I.1996. Cronartium quercuum. Distuib. Maps Pl. Dis. 708 : 1-4.

　　[7] Mordue J.E.M. , and Gibson , I.A. S. , 1978. cronartium coleosporioides.C. M.I. Descript. Pathog. Fungi Bact. 577 : 1-2.

　　[8] Andrews E.A. , Harrison M.D. , 1959 cronartium comandraein Wyoming Pl. Dis. Reporter 43 : 418-419 .

　　[9] Mordue J. E. M. , and Gibson , I. A. S. , 1978. cronartium comandrae.C. M. I. Descript. Pathog. Fungi Bact. 578 : 1-2.

　　[10] Mordue J. E. M. , and Gibson , I. A. S. , 1978. cronartium comptoniae.C. M. I. Descript. Pathog. Fungi Bact. 579 : 1-2.