GB/T 36818-2018 冷杉枯梢病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36818—2018

　　冷杉枯梢病菌检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofGremmeniellaabietina(Lagerberg)Morelet

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36818—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：王颖、程颖慧、汪莹、章桂明、高瑞芳、李芳荣、史亚千、郑耘、封立平。

　　GB/T 36818—2018

　　冷杉枯梢病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了冷杉枯梢病菌[Gremmeniellaabietina(Lagerb.) M.Morelet]的检疫鉴定方法。

　　本标准适用于冷杉枯梢病菌寄主及其产品携带冷杉枯梢病菌的检疫鉴定。

　　2 基本信息

　　中文名：冷杉枯梢病菌

　　英文名：Scleroderris canker

　　学名：Gremmeniellaabietina(Lagerb.) M.Morelet

　　异名：Ascocalyx abietina(Lagerb.) Schlipf.-Bernh. , crumenula abietina Lagerb. , c.pinea( P. Karst.)Ferd. & C.A.Jorg. ,Godroniaabietina(Ellis & Everh.) Seaver,Gremmeniellaabietina var.abi- etina(Lagerb.) M.Morelet, G.abietina var.balsamea Petrini, L.E.Petrini, Lafl. & Ouell. , Lagerbergia abietina(Lagerb.)J.Reid ex Dennis, pragmoporaabietina(Ellis & Everh.) J.W.Groves, scleroderris abietina(Lagerb.)Gremmen,s.lagerbergiiGremmen.

　　无性态：Brunchorstiapinea(P.Karst.) Hhn.

　　无性态异名：Brunchorstiadestruens Erikss. , B.pinea(P.Karst.) Hhn. , B.pinea var.cembrae M. Morelet, B.pini Allesch. , B.pinea var.pinea(P. Karst.) Hhn, Excipulina pinea(P. Karst.) Hhn. , septoriapinea P.Karst.

　　分类地位：真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、柔膜菌 目 ( Helotia- les)、柔膜菌科(Helotiaceae)、Gremmeniella属。

　　传播途径：冷杉枯梢病菌主要通过水滴扩散进行近距离由传播，远距离由风或病残体传播。

　　近似种：sphaeropsissapinea、crumenulopsissororia、Gremmeniellalaricina、cenangiumferrug- inosum。

　　冷杉枯梢病菌的其他信息参见附录 A。

　　3 方法原理

　　冷杉枯梢病菌的病害症状与形态学特征是鉴定该病菌的主要依据。

　　4 仪器及用具

　　4 . 1 仪器

　　烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、光照培养箱、天平(感量 1/100 g)、冰箱、超净工作台等。

　　4 . 2 用具

　　样品袋、标签、放大镜、培养皿、载玻片、盖玻片、三角瓶、试管、烧杯、手术刀、手术剪、镊子、研钵、量筒、吸管、酒精灯、滤纸等。

　　GB/T 36818—2018

　　5 试剂

　　5 . 1 试剂

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。

　　1%次氯酸钠溶液、无水乙醇、75%乙醇、无菌蒸馏水。

　　V8 汁、麦芽提取物、马铃薯、琼脂、小麦。

　　5 . 2 培养基

　　V8 汁麦芽提取物培养基、小麦培养基、PDA培养基，配方参见附录 B。

　　6 病原菌鉴定

　　6 . 1 症状检查

　　在芽、针叶、枝条或茎上出现橘色至褐色病斑，受侵严重时会出现细弱、扭曲的嫩枝或丛枝，甚至造成枝条枯死，树干上则会形成溃疡斑。 在病斑上的黑色小点为病菌的分生孢子器，在茎或针叶上单生或聚生，深褐色至黑色，子座状，有时连成一片，约 1 mm 大小。 子囊盘一般出现在树皮、死亡枝条或针叶基部，聚生，表面开口，有短柄，在潮湿条件下呈奶油色或浅灰色。

　　将可疑样品带回实验窒做进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期等信息。

　　6 . 2 直接镜检

　　将有成熟子实体的病枝或针叶置于体视显微镜下检查，挑取病部子实体制成玻片，置于显微镜下进行镜检及病原菌的分离培养。

　　6 . 3 保湿培养

　　将有上述症状但无子实体的组织，进行保湿培养。 将枝条或针叶置于密闭的塑料盒或袋中，17 ℃下每天 16 h光照/8 h黑暗交替培养，待发现子实体时，进行显微镜检及病原菌的分离培养。

　　6 . 4 分离培养

　　6 . 4 . 1 针叶上病原菌的分离培养

　　将针叶从树梢上取下，用自来水冲洗 30 min,1%的次氯酸钠表面消毒 10 min,无菌水冲洗 3 次，在灭菌滤纸上晾干，剪成 3 mm 长小片，置于水琼脂培养基中 5 ℃ ~10 ℃黑暗培养 3 周左右，待长出菌丝后转到 V8 汁麦芽提取物培养基上 17 ℃每天 16 h/ 8 h黑暗交替培养。

　　6 . 4 . 2 树梢、树枝及茎干上病原菌的分离培养

　　取树梢、树枝及茎干的发病部位，用自来水冲洗 30 min,1%的次氯酸钠表面消毒 10 min,无菌水冲洗 3 次，在灭菌滤纸上晾干，剥去树梢、树枝及茎干的外皮，剪成 3 mm长小片，置于水琼脂培养基 5 ℃ ~ 10 ℃黑暗培养 3 周左右，待长出菌丝后转到 V8 汁麦芽提取物培养基上 17 ℃每天 16 h/ 8 h 黑暗交替培养。

　　如果不产孢，也可将病菌接种到小麦培养基上刺激产孢。

　　GB/T 36818—2018

　　6 . 4 . 3 病菌形态特征和培养性状观察

　　观察记录病菌的培养性状、形态特征包括菌落的生长速度、颜色变化、孢子的形成情况、产孢方式等。

　　7 鉴定特征

　　7 . 1 病菌培养性状

　　冷杉枯梢病菌在 V8 汁麦芽提取物培养基上生长缓慢，菌落白色、绿色或灰绿色，有时产生黄色的

　　气生菌丝，参见附录 C。 病菌生长的最低温度为- 5 ℃ ,最高温度为 30 ℃ ,最适生长温度在 13 ℃ ~ 20 ℃ 之间。

　　7 . 2 病菌形态

　　分生孢子器深褐色至黑色，子座状，多腔，无孔口;分生孢子器壁厚度为几个细胞大小，由外部硬化的深色细胞和内部的拟薄壁组织组成。 分生孢子梗在分生孢子器内排成一行，透明、圆柱状;分生孢子(芽生孢子)无色透明、梭形，分生孢子两端稍弯，具 3 个 ~ 7 个隔膜，多数三隔，分隔处不缢缩，大小

　　(25 μm~40 μm) × (3 μm~3.5 μm)。

　　子囊盘聚生，表面开口，有短柄。 子囊层奶油色，子座深褐色至黑色，边缘不明显。 囊盘被由几层深色的多边形细胞组成，向边缘硬化，不规则的细胞向外突出。 子囊稍棒形，具短柄，无囊盖，内含 8 个子

　　囊孢子，(100 μm~120 μm) × (6 . 5 μm~10 . 5 μm),子囊双囊壁。 子囊孢子双列，无色，椭圆形，有时稍

　　弯曲，末端圆形，成熟孢子三隔，分隔处不缢缩，(15 μm~22 μm) × (3 μm~5 μm) 。侧丝无色，丝状，具分隔。 参见附录 D。

　　7 . 3 与近似种及引起相似症状的病菌的区别

　　G.abietina的近似种主要是松树枯梢病菌 Sphaeropsissapinea、cr.sororia、G.laricina、红松烂皮

　　病菌 ce.ferruginosum。冷杉枯梢病菌与其近似种的形态学的主要区别为：

　　—S.sapinea分生孢子很大，(30 μm~45 μm) × (10 μm~16 μm),深褐色。

　　—cr.sororia分生孢子指状，子囊座黑色，边缘明显，具黑色刚毛。

　　—G.laricina分生孢子较短，(15 μm~23 μm) × (3 μm~4 μm) , 1 隔 ~3 隔;子囊孢子 1 隔。

　　—ce.ferruginosum 子囊孢子无分隔，椭圆形。

　　8 结果判定

　　病害症状符合 6 . 1、病菌形态学特征符合第 7 章则可判定为冷杉枯梢病菌(Gremmeniellaabietina)。

　　9 样品保存与处理

　　保存样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存 6 个月。 如发现冷杉枯梢病菌，该样品应保存 1 年，以备复验。 保存期满后，需经灭菌处理。

　　10 菌种保存与处理

　　菌株在含30%甘油的冻存管中于 -80 ℃保存，或将菌株转接在 PDA斜面上培养，待菌丝体长满斜

　　GB/T 36818—2018

　　面后，置于 4 ℃下保存，并定期转管，标注分离物来源、寄主、分离时间、鉴定人。

　　1 1 实验记录保存

　　妥善保存检测报告包括症状、病菌等图文资料。 检测报告应注明检测 日期、方法、结果等，并有检测人签名。

　　GB/T 36818—2018

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　冷杉枯梢病菌的相关资料

　　A.1 寄主范围

　　Abiesbalsamea加拿大冷杉，A.sachalinensis库叶冷杉，Larix decidua欧洲落叶松，L.gmelinii兴安落叶松，L.kaernpfer，L.leptolepis 日 本 落 叶 松，Picea abies挪 威 云 杉，P.contorta 扭 叶 云 杉， P.glauca 白云杉，P.mariana黑云杉，P.rubens红云杉，Pinussyl℃estris长白松，P.banksiana北美短叶松，P.cembra 欧洲五针松，P.densiflora 日 本红松，P.flexilis美国柔枝松，P.griffithii乔松， P.contorta扭叶松，P.monticola 山 白 松，P.mugo 欧 洲 山 松，P.nigra var. maritima 科 西 嘉 黑 松， P.nigra var.austriaca奥地利黑松，P.nigra var.corsicana科西嘉松，P.pinaster海岸松，P.pinea意大利伞松，P.ponderosa西黄松，P.radiata辐射松，P.resinosa多脂松，P.rigida刚松，P.sabiniana沙滨松，P.strobus北美乔松，P.thunbergii黑松，P.∞allichiana乔松，Pseudotsugamen≈iensii。

　　A.2 地理分布

　　欧洲：奥地利、比利时、保加利亚、捷克共和国、丹麦、爱沙尼亚、芬兰、法国、德国、希腊、冰岛、意大利、卢森堡、斯洛文尼亚、斯堪的纳维亚、阿尔巴尼亚、克罗地亚、拉脱维亚、立陶宛、匈牙利、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、白俄罗斯、俄罗斯(欧洲部分)、乌克兰、摩尔多瓦、西班牙、葡萄牙、瑞典、瑞士、列支敦士登公国、英格兰、苏格兰、爱尔兰、前南斯拉夫、斯洛伐克、塞尔维亚和黑山共和国、阿塞拜疆、波斯尼亚和黑塞哥维那、格鲁吉亚、塞浦路斯、马其顿。

　　非洲：摩洛哥、阿尔及利亚、南非、苏丹、利比亚、突尼斯、肯尼亚、津巴布韦。

　　美洲：圣皮埃尔和密克隆、厄瓜多尔、加拿大、美国、墨西哥、哥伦比亚、阿根廷、乌拉圭、智利、秘鲁。

　　亚洲：哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、日本、韩国、缅甸、尼泊尔、巴基斯坦、蒙古、伊朗、以色列、印度、不丹、阿富汗、黎巴嫩、叙利亚、土耳其、中国台湾。

　　大洋洲：澳大利亚、新西兰、新喀里多尼亚。

　　GB/T 36818—2018

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　培 养 基

　　B.1 V8 汁麦芽提取物培养基

　　每 1 000 mL V8 汁麦芽提取物培养基由 200 mL V8 汁、20 g麦芽提取物、20 g琼脂、800 mL蒸馏水配制而成，121 ℃高压灭菌 20 min。

　　B.2 小麦培养基

　　100 mL三角瓶中加 25 mL蒸馏水、10 g小麦，121 ℃高压灭菌 20 min。

　　B.3 PDA培养基

　　去皮马铃薯 200 g,切碎，加适量蒸馏水煮沸 20 min左右，双层纱布过滤，葡萄糖 18 g,琼脂 20 g,加蒸馏水补足 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌 20 min。

　　GB/T 36818—2018

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　冷杉枯梢病菌症状及培养性状图

　　冷杉枯梢病菌症状及培养性状图见图 C. 1 。

　　a) b)

　　c) d)

　　e)

　　注：a)、b)、c)、d) 为症状图(引 自 Petr Kapitola,2002);e) 为培养性状图。

　　图 C.1 冷杉枯梢病菌症状及培养性状图

　　GB/T 36818—2018

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　冷杉枯梢病菌病原形态特征图

　　冷杉枯梢病菌病原形态特征图见图 D. 1 。

　　a)分生孢子器 b)分生孢子

　　c)子囊盘 d)子囊及子囊孢子

　　注：仿自 E.Puninthalingam& I.A.S.Gibson, 1973.

　　图 D.1 冷杉枯梢病菌病原形态特征

　　GB/T 36818—2018

　　参 考 文 献

　　[1] OEPP/EPPO.2009.Bulletin OEPP/EPPO Bulletin39 : 310~317.

　　[2] Puninthalingam, E,etal.Gremmeniellaabietina.CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria No.369.CABInternational, Wallingford, UK.

　　[3] Dorworth CE,etal.1975.Comparisons among isolates of Gremmeniellaabietina by means of growth rate,conidia measurements,and immunogenic reaction.canadianJournalof Botany.53 :2506~2525.

　　[4] Hudller GW, etal.1984 . Production and maintenance of conidia of Gremmeniellaabietina. Plant Dis, 68 : 1065~1066.

　　[5] http://www.nrcan.gc.ca/

　　[6] http://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/index.cfm

　　[7] http://www.cabi.org/cpc/