GB/T 36812-2018 马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36812—2018

　　马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法

　　Moleculardetectionmethodofpotatoyellowdwarfvirus

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36812—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国福清出入境检验检疫局、福建农林大学、中国检验检疫科学研究院。

　　本标准主要起草人：沈建国、蔡伟、高芳銮、张永江、陈细红、李敏、王宇、吴祖建、陈寿铃。

　　GB/T 36812—2018

　　马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了马铃薯黄矮病毒(potatoyello∞d∞arf℃irus)的分子生物学检测方法。

　　本标准适用于可能携带马铃薯黄矮病毒的植物及植物产品检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　3 马铃薯黄矮病毒基本信息

　　中文名：马铃薯黄矮病毒

　　学名：potatoyello∞d∞arf℃irus，缩写：PYDV。

　　分类地位：弹状病毒科(Rhabdo℃iridae)、细胞核弹状病毒属(Nucleorhabdo℃irus)。

　　马铃薯黄矮病毒的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　马铃薯黄矮病毒的分子生物学特性是制定本检测方法的主要依据。

　　5 仪器、用具及试剂

　　5 . 1 仪器

　　高速冷冻离心机、电子天平、PCR仪、荧光 PCR仪、水平电泳系统、-20 ℃低温冰箱和- 80 ℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH 计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台等。

　　5 . 2 用具

　　可调移液器(2.5 μL, 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL, 1 000 μL)和可调移液器枪头、离心管、研

　　钵等。

　　5 . 3 试剂

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。 RT-PCR 检测试剂见附录 B;实时荧光 RT-PCR 检测试剂见附录 C。

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　　6 抽样和样品制备

　　6 . 1 抽样

　　尽量抽 取 有 病 毒 危 害 症 状 的 植 物 材 料，PYDV 的 危 害 症 状 描 述 参 见 附 录 A;抽 样 方 法 按 照SN/T 2122中规定执行。

　　6 . 2 样品制备

　　分别按照有症和无症进行样品制备，具体方法按照 SN/T 2964 和 SN/T 3457 中规定执行。

　　7 检测鉴定

　　7 . 1 RT-PCR检测

　　以含 PYDV 材料作为阳性对照，以不含 PYDV 的健康植物组织作为阴性对照，同时以双蒸水代替

　　模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成 cDNA后进行 PCR检测，具体操作见

　　附录 B。 如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。

　　7 . 2 实时荧光 RT-PCR检测

　　以含 PYDV 材料作为阳性对照，以不含 PYDV 的健康植物组织作为阴性对照，同时以双蒸水代替

　　模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成 cDNA后进行实时荧光 PCR检测，具

　　体操作见附录 C。 如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。

　　8 结果判定

　　样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行：

　　—RT-PCR初步筛检，若检测结果为阴性，则判定样品不携带 PYDV;若检测结果为阳性，则采用PCR产物序列测定或实时荧光 RT-PCR进行验证;

　　— 若验证结果为阳性，则判定样品携带 PYDV;若验证结果为阴性，则判定样品不携带 PYDV。

　　9 样品保存与结果记录

　　9 . 1 样品保存

　　经检测确定携带 PYDV 的 样 品 应 保 存 在 适 合 的 条 件 下 以 备 复 核。 种 苗、叶 片 等 样 品 保 存 在

　　-80 ℃冰箱中;做好登记和标记工作，保存期限至少 1 年。

　　9 . 2 结果记录

　　记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。 RT-PCR 检测应有电泳图片;实时荧光 RT-PCR 检测应有实时荧光结果图片。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　马铃薯黄矮病毒相关资料

　　A.1 寄主范围

　　已报道的寄主包括茄科、夹竹桃科、菊科、十字花科、唇形科、豆科、蓼科和玄参科植物，主要 自然寄

　　主为马铃薯(solanum tuberosum)。

　　A.2 病害症状

　　侵染马铃薯引起病株矮缩、黄化，茎的生长点早期坏死等症状(见图 A. 1) 。

　　注：引 自 Cornell University, Bugwood.org。

　　图 A.1 PYDV侵染马铃薯引起的症状

　　A.3 分布地区

　　主要分布于加拿大、美国。

　　A.4 传播途径

　　主要经昆虫介体叶蝉 Aceratagalliasanguinolenta、Aceratagallia sp.、Agalliaconstricta传播，也

　　可通过带毒种薯、块茎远距离传播。

　　A.5 粒体形态

　　病毒粒体有包膜，杆菌状或子弹状，大小约 380 nm×75 nm。

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　　A.6 病毒基因组

　　负义单链 RNA病毒，全长约 12 875 bp。

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　　附 录 B (规范性附录) RT-PCR检测

　　B.1 试剂

　　B.1 . 1 Trizol 裂解液 。

　　B.1 .2 5 × TBE缓冲液：

　　Tris 碱 54.0 g

　　硼酸(H3 BO3) 27.5 g

　　0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 20 mL

　　补充蒸馏水至 1 L。用时加蒸馏水稀释至 0.5 × TBE。

　　B.1 . 3 三氯甲烷。

　　B.1 . 4 异丙醇 。

　　B.1 . 5 75%乙醇 。

　　B.1 . 6 无水乙醇。

　　B.1 . 7 RT缓冲液。

　　B.1 . 8 dNTPs : 10 mmol/ L。

　　B.1 .9 M-MLV RT: 200 U/μL。

　　B.1 . 10 RNasin: 40 U/μL。

　　B.1 . 1 1 Taq PCR mix。

　　B.1 . 12 引物序列：

　　根据已报道的 PYDV基因组序列设计 1 对用于特异性扩增的引物。

　　正向引物 PYDV-F: 5′-ATATTCATTTCCAGGCTTGCAT-3′

　　反向引物 PYDV-R: 5′-CTATTTTCCCCTCAGTAGTCCAC-3′

　　PCR产物大小 588 bp。

　　B.2 RT-PCR检测

　　B.2 . 1 总 RNA提取

　　取 0.1 g样品组织置于研钵中，加入液氮充分研磨至粉末状后迅速移入 1. 5 mL 离心管，再加入 1 mL Trizol裂解液，剧烈震荡摇匀 3 min; 4 ℃ , 12 000 g离心 10 min,取上清液;加入三氯甲烷300 μL,剧烈震荡 15 s,室温静置 5 min, 4 ℃ , 12 000 g离心 15 min,取上层水相;加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置 15 min, 4 ℃ , 12 000 g离心 10 min,弃上清液;加入 1 mL 75%的乙醇洗涤沉淀 2 次，每次 4 ℃ , 7 500 g离心 3 min,弃上清液;RNA沉淀干燥后，用 20 μL~40 μL 经 DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的双蒸水溶解，-80 ℃保存备用。

　　B.2 . 2 CDNA合成

　　在 PCR 管中加入 3 μL 总 RNA, 1 μL 反向引物(PYDV-R, 10 μmol/L),双蒸水7 μL, 70 ℃水浴10 min,迅速冰浴 5 min,再加入下列试剂：5 × RT 缓冲液 5 μL、dNTPs(10 mmol/L) 2 μL、M-MLV RT

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　　(200 U/μL) 1 μL、RNasin(40 U/μL) 1 μL。42 ℃水浴 60 min, 70 ℃水浴 10 min, 自然冷却至室温， -20 ℃保存备用。

　　B.2 . 3 PCR扩增

　　PCR反应体系见表 B. 1,每个反应设置 2 个重复。

　　PCR 反应条件：94 ℃ 3 min, 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min,共 35 个循环;72 ℃ 10 min。

　　表 B.1 PCR反应体系

　　B.2 . 4 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置

　　B.2 . 4 . 1 阴性对照：不含 PYDV 的健康植物组织。

　　B.2 . 4 . 2 阳性对照：含 PYDV 材料。

　　B.2 . 4 . 3 空白对照：双蒸水。

　　B.2 . 5 琼脂糖凝胶电泳

　　制备 1. 5% 的 琼 脂 糖凝 胶，对 PCR 产 物 进 行 电 泳。电 泳 结 束 后，在 溴 化 乙 锭 ( EB, 浓 度 为0.5 μg/mL)溶液染色 10 min,再在凝胶成像分析系统中观察是否扩增出预期的特异性 DNA 电泳带，拍

　　照并做记录。

　　B.2 . 6 结果判断

　　如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，阳性对照在 588 bp 大小处有扩增条带，待测样品出现与

　　阳性对照一致的扩增条带，则判定为阳性。

　　如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，阳性对照在 588 bp 大小处有扩增条带，待测样品未出现

　　与阳性对照一致的扩增条带，则判定为阴性。

　　如果采用 PCR产物序列测定方法进一步确认，当序列测定得到的核苷酸序列与已知的 PYDV 序列一致，则判定样品携带 PYDV;若序列不一致，则判定样品不携带 PYDV。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR检测

　　C.1 试剂

　　核酸提取、反转录试剂同 B. 1 。

　　TaqMan PCR mix。

　　C.2 引物及探针

　　实时荧光 RT-PCR 检测引物及探针见表 C. 1 。

　　表 C.1 实时荧光 RT-PCR检测引物及探针

　　C.3 总 RNA提取

　　方法同 B. 2 . 1 。

　　C.4 CDNA合成

　　方法同 B. 2 . 2 。

　　C.5 实时荧光 PCR反应

　　实时荧光 PCR反应体系见表 C. 2,每个反应设置 2 个重复。

　　反应程序：95 ℃ 10 s, 95 ℃ 5 s, 55 ℃ 10 s, 72 ℃ 20 s,共 40 个循环。

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　　表 C.2 实时荧光 PCR反应体系

　　C.6 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置

　　同 B. 2 . 4 。

　　C.7 结果判定

　　在空白对照及阴性对照无 Ct 值且无扩增曲线、阳性对照 Ct 值 ≤ 30 并出现典型扩增曲线的条

　　件下：

　　待测样品的 Ct值>40 时，判定 PYDV 阴性。

　　待测样品的 Ct值<35 时，判定 PYDV 阳性。

　　待测样品的 35≤Ct值≤40 时，应重新进行测试;如果重新测试的 Ct 值 ≥40 时，判定 PYDV 阴性;如果重新测试的 Ct值<40,则判定 PYDV 阳性。

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　　参 考 文 献

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