GB/T 36810-2018 草莓枯萎病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36810—2018

　　草莓枯萎病菌检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofFusariumoxysporum(Schlecht.)f.sp.

　　Fragariaewinks& williams

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36810—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：刘跃庭、罗加凤、牛春敬、崔铁军、廖芳。

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　　草莓枯萎病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了草莓枯萎病菌的检疫鉴定方法。

　　本标准适用于草莓苗中及其携带土壤中草莓枯萎病菌的检疫鉴定。

　　2 草莓枯萎病菌的基本信息

　　中文名：草莓枯萎病菌

　　学名：Fusarium oxysporum (Schlecht.) f. sp. fragariaeWinks & Williams

　　英文名：fusarium wilt of strawberry

　　分类地位：草莓枯萎病菌属真菌界(Fungi), 子囊菌门(Ascomycota), 盘菌亚门(Pezizomycotina) ,粪壳菌纲(Sordariomycetes), 肉座菌目(Hypocreales),丛赤壳科(Nectriaceae),镰刀菌属(Fusarium)。

　　传播途径：病菌依靠带菌种苗和土壤进行远距离传播。

　　草莓枯萎病菌的其他信息参见附录 A。

　　3 方法原理

　　病原菌的为害症状、分离培养性状、形态特征及 PCR 特异性扩增片段作为草莓枯萎病菌的检疫鉴定依据。

　　4 仪器用具和主要试剂

　　4 . 1 仪器用具

　　显微镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平、高压灭菌锅、常规冰箱(- 20 ℃ ) 。PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅。

　　培养皿、三角瓶、镊子、手术剪、手术刀、接种针、移液器、酒精灯。

　　4 . 2 主要试剂

　　乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基磺酸钠(SDS)、Tris-HCl、异戊醇、三氯甲烷、无水乙醇、70% 乙醇、氯化钾、氯化镁、蛋白酶 K、引物 FofraF/FofraR、Taq聚合酶等分子生物学试剂。 或用植物组织及真菌基因组提取试剂盒提取 DNA。 蔗糖、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素、0 . 5%次氯酸钠 ( NaClO) 。

　　马铃薯蔗糖培养基(PSA)、马铃薯葡萄糖培养基(PDA)的制备参见附录 B。

　　5 病菌的鉴定

　　5 . 1 症状检查

　　取待检植株，观察植株有无生长不良、矮小衰弱及腐烂症状，下部叶片是否变紫红色萎蔫，心叶是否

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　　变黄绿或黄色，纵切叶柄、果梗和根部，检查维管束是否变色(参见附录 A 中图 A. 1),对变色的可疑材料进行分离培养。 检查植株有无附着土壤，若发现土壤，对土壤进行分离培养。

　　5 . 2 病原菌的分离培养

　　5 . 2 . 1 种苗中病原菌的分离培养

　　变色的可疑材料用 0 . 5%次氯酸钠表面消毒 5 min,再用灭菌水冲洗 30 min,剪成约 3 mm~5 mm小段置 PSA或 PDA平板上，25 ℃ ,全光照下培养，培养 48 h后开始观察菌落形态、大分生孢子、小分生孢子及厚垣孢子着生情况和形态特征。

　　5 . 2 . 2 土壤中病原菌的分离培养

　　取 2 g 土壤放入 200 mL 灭菌水中，用磁力棒搅拌 30 min, 使其充分混匀，悬浮液稀释 10 倍，取0 . 5 mL 土壤稀释液涂抹于 PSA或 PDA 平板上，每处理涂抹 5 个培养皿，25 ℃ ,全光照下培养，培养48 h 后开始观察菌落形态、大分生孢子、小分生孢子及厚垣孢子着生情况和形态特征。

　　5 . 3 分子生物学鉴定

　　5 . 3 . 1 引物

　　采用特异性引物 FofraF/ FofraR进行扩增，目标片段为 239 bp。

　　FofraF: 5′-CAGACTGGGGTGCTTAAAGTT-3′

　　FofraR: 5′-AACCGCTAGGGTCGTAACAAA-3′

　　5 . 3 . 2 DNA提取

　　可疑菌株在 PSA或 PDA上生长 7 d左右，取菌丝提取 DNA(参见附录 C),也可用植物组织及真菌基因组提取试剂盒提取 DNA,提取步骤详见使用说明。

　　5.3.3 PCR反应

　　PCR 反 应 体 系 总 体 积 25 μL, 包 含：EmeraldAmp Max PCR Master Mix ( 2 × Premix) ( Code RR320) 12.5 μL;ddH2 O 9.0 μL;引物各 1.0 μL;DNA模板 1.5 μL (30 ng/μL)。PCR 反应程序：94 ℃预变性 2 min; 94 ℃变性 1 min, 63 ℃复性 1 min, 72 ℃延伸 1 min, 30 个循环;72 ℃ 7 min,保存于 4 ℃。

　　扩增产物在 2 . 0%琼脂糖凝胶 1 × TAE 缓冲液中电泳，EB染色后凝胶成像，分析是否出现目标片段大小的单带。

　　6 鉴定特征

　　6 . 1 培养性状

　　在 PSA培养基平板上菌落突起，白色致密呈絮状，高 3 mm~5 mm,菌落正面有同心轮纹，背面菌落呈紫色。 在 PDA培养基上，2 d后出现白色菌丝，3 d后开始产孢，7 d后菌落呈圆形，边缘白色，向内逐渐变成粉红色，菌丝细绒状、蓬松，背面菌落呈紫色(参见附录 D 中图 D. 1) 。

　　6 . 2 形态特征

　　菌丝有隔，小型分生孢子居多，着生于单生瓶梗上，常在瓶梗顶端处聚成假头状，无色，单孢，长椭圆

　　形，椭圆形或卵形，无或有 1 个分隔，大小为(3 . 9 μm~13 . 0 μm) × (2 . 6 μm~5 . 2 μm);大型分生孢子较少，镰刀形或新月形，有脚胞，1 个 ~ 4 个分隔，多为 3 隔，大小为 ( 13. 0 μm~ 36. 4 μm) × (2. 6 μm~

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　　5.2 μm)。厚垣孢子间生或顶生，球形，大小为(5.2 μm~13.00 μm) × (5.2 μm~13.0 μm)(参见附录 D

　　中图 D. 2) 。草莓枯萎病菌与其近似种的区别参见附录 E。

　　6 . 3 PCR特异性产物

　　引物 FofraF/FofraR特异性 PCR扩增片段为 239 bp。

　　7 结果判定

　　病原菌培养性状符合 6 . 1 中描述，形态特征符合 6 . 2 中描述，PCR 特异性扩增片段符合 6 . 3 中描述可鉴定为草莓枯萎病菌。

　　8 样品保存

　　8 . 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存。 对检出草莓枯萎病菌的样品应保存于 4 ℃冰箱中，以备复核 。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。

　　8 . 2 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为草莓枯萎病菌的菌株，应妥善保存。 将菌株接种于 PSA 培养基斜面上，存活后置于 4 ℃ ~8 ℃黑暗条件下保存，定期(3 个月)转接，以防止病菌死亡，至少保存 6 个月，必要时用病菌分生孢子作冻干菌种保存。 保存期满后高压灭活处理。

　　8 . 3 结果记录与资料保存

　　实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并有实验人员和审核人员签字。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　草莓枯萎病菌的其他信息

　　A.1 寄主范围

　　草莓属 Fragaria L.。

　　A.2 地理分布

　　欧洲：波兰、西班牙;

　　美洲：美国;

　　非洲：埃及;

　　亚洲：日本，韩国，中国的四川、河北、东北三省、上海;

　　大洋洲：澳大利亚。

　　A.3 症状特征

　　草莓枯萎病菌主要侵害根部，表现在地上部分，从开花及收获期发生，心叶变黄绿或黄色卷曲，小叶变狭小或呈船形，多数变硬。 叶色变黄，表面粗糙无光泽，随后叶缘变褐，向内萎蔫，直至枯死。 病菌引起系统症状，导致病株根系坏死，生长不良，矮小衰弱，叶无光泽，下部叶片变紫红色萎蔫，叶柄和果梗的维管束变褐色或黑褐色，不长新根，潮湿时近地面基部长出紫红色的分生孢子，最后全株枯死，轻病株则结果减少，果实不能正常膨大，品质低劣。 草莓枯萎病菌症状如图 A. 1 所示。

　　注：引 自 Hossein Golzar, Australia。

　　图 A.1 草莓枯萎病菌症状

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　　A.4 传播途径

　　草莓枯萎病菌是尖孢镰刀菌草莓专化型，不能侵害其他作物，只能通过带病种苗和病土传播。 病害__旦传入，便在采苗床、假植床和大田循环侵染，扩大蔓延，难以除治。 土壤传染主要以厚垣孢子作传染源，而且病菌无论在旱地或水田都能长期生存，并且在 20 cm 的土层内密度最高。 如果翌年在带有病菌的地里育苗，病菌先侵染母株，然后通过匍匐茎、导管再传给子苗，因为苗期症状不明显，而被当作健苗来移栽。 __般靠近母株的苗子发病早，带病率高，发病也严重。 病原菌主要靠病根、病叶通过土壤和水进行扩散传播。 酸性潮湿的土壤、夏季持续高温多雨和偏酸的灌溉水均能导致草莓枯萎病菌的严重发生，冬春季低温干燥时该病发生较轻。

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　　附 录 B (资料性附录)培养基的制备

　　B.1 马铃薯蔗糖培养基(PSA)

　　马铃薯去皮后洗净，切成小块，称取 200 g,蒸馏水中煮 30 min,用 4 层纱布过滤，加入 10 g~20 g蔗糖、17 g~20 g琼脂，加热使之完全溶解，蒸馏水定容至 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌 15 min。 为抑制细菌生长，高压灭菌后在 50 ℃ ~60 ℃时，每 100 mL培养基加入青霉素 5 mg,链霉素 3 mg。

　　B.2 马铃薯葡萄糖培养基(PDA)

　　马铃薯去皮后洗净，切成小块，称取 200 g,蒸馏水中煮 30 min,用 4 层纱布过滤，加入 10 g~20 g葡萄糖、17 g~20 g琼脂，加热使之完全溶解，蒸馏水定容至 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌 15 min。 为抑制细菌生长，高压灭菌后在 50 ℃ ~60 ℃时，每 100 mL培养基加入青霉素 5 mg,链霉素 3 mg。

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　DNA提取方法

　　DNA提取步骤如下：

　　a) 挑取菌丝约 0 . 1 g,用灭菌滤纸吸干水分，放入 1 . 5 mL离心管中，加液氮冷冻，用塑料杵磨碎菌丝，待用。

　　b) 离心管中加入 400 μL~500 μL CTAB缓冲液和 0.1 g蛋白酶 K,混匀，65 ℃水浴 1 h, 14 000 g离心 5 min,保留上清液。

　　c) 取上清液，加 500 μL 的 Tris 饱和酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1) 混匀，14 000 g 离心5 min 。

　　d) 取上清液于 1 . 5 mL离心管中，加 500 μL三氯甲烷 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1),轻摇混匀，14 000 g离心5 min 。

　　e) 取上清液，加入 1 mL异丙醇混匀，-70 ℃下放置 1 h,或 -20 ℃过夜;13 000 g 离心 10 min,可见 DNA沉淀。

　　f) 弃去上清液，冷70%乙醇洗 DNA沉淀 2 次，室温干燥;用 30 μL~50 μL Tris-EDTA缓冲液溶解 DNA。

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　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　草莓枯萎病菌的培养性状和形态特征

　　PDA培养基上草莓枯萎病菌菌落形态如图 D. 1 所示。

　　说明：

　　A —PDA上菌落正面观;

　　B — 培养基底部菌落产生紫色色素。

　　图 D.1 PDA培养基上草莓枯萎病菌菌落形态

　　病菌形态特征如图 D. 2 所示。

　　说明：

　　A —单出瓶状分生孢子梗(标尺= 25 μm, 引 自 Hossein Golzar, Australia) ;

　　B — 小型分生孢子;

　　C — 厚垣孢子;

　　D — 大型分生孢子。

　　图 D.2 病菌形态特征

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　　附 录 E

　　(资料性附录)

　　草莓枯萎病菌与草莓上其近似种的区别

　　草莓枯萎病菌与草莓上其近似种的区别见表 E. 1 。

　　表 E.1 草莓枯萎病菌与草莓上其近似种的区别

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　　参 考 文 献

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