GB/T 36755-2018 BST DNA聚合酶

　　ICS 07 . 080 C 27

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36755—2018

　　BST DNA聚合酶

　　BST DNA Polymerase

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36755—2018

　　GB/T 36755—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG 11)归口 。

　　本标准起草单位：中国科学院微生物研究所、厦门致善生物科技股份有限公司、福建华灿制药有限公司、福建南生科技有限公司、安琪酵母股份有限公司、上海博仕生物医学服务中心、北京化工大学。

　　本标准主要起草人：李晶、宋娜杰、黄发灿、刘文军、詹学雄、郑登忠、李庆阁、赵晶、章丽丽、姚鹃、邢志刚、陈劲春。

　　GB/T 36755—2018

　　引

　　言

　　BST DNA 聚合酶(BST DNA polymerase) 是嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophilus)

　　DNA 聚合酶的一部分，具有 5′→ 3 ′DNA 聚合酶活性，但不具有 5′→ 3′外切核酸酶活性。 制定 BST DNA 聚合酶国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于 BST DNA 聚合酶的生产和使用具有重要意义。

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　　BST DNA聚合酶

　　1 范围

　　本标准规定了 BST DNA 聚合酶的技术要求、检验方法、包装、运输、贮存和保质期。

　　本标准适用于通过基因重组表达中提取的 BST DNA 聚合酶。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 191 包装储运图示标志

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　BST DNA聚合酶 BST DNA Polymerase

　　嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus) DNA 聚合酶的一部分，具有 5 → 3′DNA 聚合酶活性，但不具有 5′→ 3′外切核酸酶活性。

　　3.2

　　BST DNA聚合酶活性单位 activityunitofBST DNA Polymerase

　　以合成的发夹型寡核苷酸序列作为模板/引物，在 65 ℃ 、1 min 内，将 1 . 29 nmol脱氧核苷酸聚合成双链 DNA 中所需的酶量为 1 活力单位(U) 。

　　4 技术要求

　　4 . 1 外观

　　澄清透明的液体，无沉淀。

　　4 . 2 酶活力

　　≥8 000 U/mL。

　　4 . 3 杂质

　　不应含有核酸外切酶和核酸内切酶。

　　5 检验方法

　　5 . 1 外观

　　直接或将样品倒入无色透明试管中，在自然光条件下，肉眼观察。

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　　5 . 2 酶活力

　　依据附录 A 的方法进行检测。

　　5 . 3 杂质

　　5 . 3 . 1 核酸外切酶

　　依据附录 B 的方法进行检测。

　　5 . 3 . 2 核酸内切酶

　　依据附录 C 的方法进行检测。

　　6 包装、运输及贮存

　　6 . 1 包装

　　内包装材料应洁净无污染，封口应严密，无泄漏。 外包装箱储运图示标志应符合 GB/T 191 的规定。

　　6 . 2 运输

　　产品应在冷冻条件下运输，运输工具应清洁卫生、干燥，并有防雨、防晒设施，运输过程中应做好防护措施避免倒置及破损。 不宜与有毒、有害、有异味物品混运。

　　6 . 3 贮存

　　应在温度低于 -20 ℃的条件下储存。

　　7 保质期

　　在符合本标准规定的条件下，包装完好未启封的产品保质期为 3 年;超过保质期，使用前应检测酶活。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　BST酶活力检测

　　A.1 仪器设备

　　荧光 PCR仪。

　　A.2 试剂

　　A.2 . 1 发夹型寡核苷酸序列(T2),序列为：

　　5′-tagcgaaggatgtgaacctaatcccTGCTCCCGCGGCCGatctgcCGGCCGCGGGAGCA-3

　　A.2 . 2 dNTP。

　　注：dGTP：三磷酸鸟嘌呤 脱 氧 核 苷 酸;dATP：三 磷 酸 腺 嘌 呤 脱 氧 核 苷 酸;dTTP：三 磷 酸 胸 腺 嘧 啶 脱 氧 核 苷 酸;

　　dCTP：三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。 dNTP指三磷酸碱基脱氧核苷酸，包括 dGTP、dATP、dTTP、dCTP。

　　A.2 . 3 荧光核酸染料。

　　A.2.4 Lamda DNA标准品。

　　A.3 试剂溶液配制

　　A.3. 1 1×TE溶液：10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液，pH 8.5(25 ℃ )。

　　A.3.2 PCR 缓冲液：250 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L硫酸铵溶液，500 mmol/L 氯化钾溶液，1%(体积分数)TritonX-100, pH 8.5(25 ℃ )。

　　A.3.3 Lambda DNA 预染液：以 8.5 μL: 1 μL: 0.5 μL 的比例分别量取纯化水、10×PCR缓冲液和荧光核酸染料加入离心管，在漩涡混匀器上振荡混匀 1 min 后在微型离心机上离心数秒，储存于 2 ℃ ~ 8 ℃ 。

　　A.3.4 氯化镁溶液：25 mmol/L。

　　A.3.5 酶稀释缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl, 0. 1 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液，1 mmol/L DTT, 50%(体积分数)甘油，pH 8.0(25 ℃ )。

　　A.3.6 T2 溶液：将发夹型寡核苷酸序列(T2) 干粉按照合成单上的说明稀释到 100 μmol/L,储存于

　　-20 ℃ 。使用时从 -20 ℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上混匀 10 s,在微型离心机上离心数秒。

　　A.3.7 dNTP混合液：将 dNTP 中的 dCTP、dATP、dTTP、dGTP 等体积进行混合，于漩涡混匀器上混匀 10 s,在微型离心机上离心数秒，配制成浓度为 25 mmol/ L 的 dNTP混合液。

　　A.3.8 Lambda DNA标准品：使用 1×TE溶液将 Lambda DNA 标准品进行 4 倍连续梯度稀释，得到

　　100 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.125 μg/mL、1.562 5 μg/mL 和 0.781 25 μg/mL 的8 个浓度梯度溶液，以相同体积的 1×TE溶液作为背景对照。 各梯度溶液和背景对照分别加入等体积的预染液，于漩涡混匀器上混匀 10 s,在微型离心机上离心数秒，以 20 μL/管分装于 PCR八联管内，每

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　　个梯度 3 个重复，盖紧管盖，在微型离心机上离心数秒后备用。

　　A.3 . 9 BST DNA 聚合酶梯度稀释溶液：根据标定的酶比活力，使用酶稀释缓冲液对 BST DNA 聚合酶进行适当稀释(如标定浓度为 5 000 U/ mL, 即 5 U/μL,则可 2 倍稀释，得到 2 × 、4× 、8 × 、16 × 的梯度稀释液)。该步骤需在冰上进行。

　　A.4 试验步骤

　　A.4 . 1 聚合反应液的配制与分装

　　A.4 . 1 . 1 在微量离心管中按照表 A. 1 的比例配制聚合反应液(冰上配制)，聚合反应液配制完成后，在漩涡混匀器涡旋混匀 10 s,微型离心机离心数秒。

　　配制总体积计算见式(A. 1) :

　　犞=[3 ×(狀+ 1) +1] ×犞1 …………………………( A.1 )

　　式中：

　　犞 — 总体积，单位为微升(μL) ;

　　3 — 重复次数;

　　狀 —BST DNA 的稀释梯度数;

　　1 — 前一个 1 表示空白对照数，后一个 1 表示预留损失数量;

　　犞1 — 1 个反应用量，见表 A. 1;单位为微升(μL) 。

　　表 A.1 聚合反应液配比

　　A.4 . 1 . 2 将 A. 4 . 1 . 1 中的聚合反应液平均分装到狀 个(狀为 BST DNA 的稀释梯度数)微量离心管中，分别加入 1 . 3 μL 的各浓度梯度的 BST DNA 聚合酶梯度稀释溶液和空白对照(酶稀释缓冲液)，在漩涡混匀器涡旋混匀 10 s,微型离心机离心数秒。 各管混合液以 20 μL/管，分装于 PCR八联管内，每管混合液3 个重复，盖紧管盖，在微型离心机上离心数秒后备用。

　　A.4 . 2 运行程序

　　在荧光 PCR仪上设置如下温度程序：

　　65 ℃ 16 s

　　荧光采集通道：SYBR

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　　120 循环

　　将装有 Lambda DNA标准品和聚合反应液的 PCR 八联管置于荧光 PCR 仪中，启动温度程序，开始聚合反应。

　　A.5 数据分析

　　A.5. 1 LambdaDNA标准曲线的制作

　　使用荧光 PCR仪的软件打开数据，导出文件，按以下步骤进行，按式(A. 2)计算：

　　a) 选取导出数据文件中 Lambda DNA标准品和背景对照的第 25 个循环的荧光值，并计算平均荧光值;

　　b ) 将各梯度 Lambda DNA标准品的荧光值减掉背景对照的平均荧光值，得到净荧光值;

　　c) 计算各梯度净荧光值的平均值和标准偏差 SD;

　　d) 以 Lambda DNA标准品 DNA量(ng)为 X 轴，以各梯度净荧光值的平均值为 Y 轴，标准偏差SD 为错误值进行多项式拟合分析，制作工作曲线，从中获得净荧光值与双链 DNA 浓度的关系曲线如下，R2 ≥0 . 98 。

　　y=A+Bx …………………………( A.2 )

　　式中：

　　A — 线性方程拟合曲线的截距;

　　B — 线性方程拟合曲线的斜率;

　　y —荧光值;

　　x —双链 DNA 的量，单位为纳克(ng) 。

　　A.5 . 2 聚合反应新生成的双链 DNA量的计算

　　选取数据文件中待检 BST DNA 聚合酶的第 25 个循环的荧光数据。 首先计算空白对照 3 个重复的平均荧光值，将各梯度 BST DNA 聚合酶的荧光值减掉空白对照的平均荧光值，得到净荧光值，计算各梯度净荧光值的平均值(y1) 。将各净荧光值代入式(A. 2)计算聚合反应新生成的双链 DNA量(x1) 。

　　A.5 . 3 各 BST DNA聚合酶梯度条件下的 dNTP消耗量计算

　　各 BST DNA 聚合酶梯度条件下的 dNTP 消耗量以 y2 表示，单位为 nmol,按式(A. 3)计算：

　　y …………………………( A.3 )

　　式中：

　　x1 —新生成的双链 DNA量，单位为纳克(ng) ;

　　2 — 双链 DNA 由 2 条单链 DNA组成;

　　324.5 —dNTP 的相对平均分子质量。

　　A.5.4 BST DNA聚合酶活力计算

　　根据 3 . 2 BST DNA 聚合酶活性单位定义，BST DNA 聚合酶酶活力以 S 表示，单位为 U/ mL。 选

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　　择在 0.019 3 nmol~0.281 nmol 范围内的 dNTP 消耗量按照式(A.4)计算：

　　犛 …………………………( A.4 )

　　式中：

　　狔2 —dNTP 消耗量，单位为纳摩尔(nmol) ;

　　犇 — 酶的稀释倍数。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)核酸外切酶检测

　　B.1 原理

　　由于 BamH Ⅰ 切开 DNA双链产生一对粘性末端，其各有五个碱基失去互补碱基形成突出单链，它易受核酸外切酶作用丢失若干个碱基乃至形成平末端;如果将此 DNA连接后再用 BamH Ⅰ 酶切，结果是无法切开。 如果该位点是在外显子区或编码区，即意味其对应的氨基酸序列发生变化，乃至某些生物性状发生改变。 例如质粒 pBR322 所含 BamH Ⅰ 识别位点是在其抗四环素基因上，如果使用被核酸外切酶污染的样品 BamH Ⅰ 过量长时程切割 pBR322,然后再连接闭环后重新转化受体菌，该菌在含四环素培养基上无法生长，而没有这样酶切的 pBR322 转化菌能够生长。 又如质粒 pUC19 所含 BamH Ⅰ 位点居于编码 Lac Z 的 α互补肽上，若发生前述状况，就会导致该肽链的氨基酸序列变化，最终在含异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和 β-半乳糖苷酶的 LB 培养基上由原本是蓝斑变成白斑。 如果白斑数 目 占到总菌斑数的 10%以上，就判定该样品已有核酸外切酶污染。

　　B.2 仪器和设备

　　B.2 . 1 恒温水浴槽。

　　B.2 . 2 台式离心机。

　　B.2 . 3 超净工作台。

　　B.2 . 4 恒温培养箱。

　　B.3 材料

　　B.3. 1 高纯 CCC pUC19 DNA。

　　B.3 . 2 T4 DNA连接酶。

　　B.3.3 10 × T4 DNA 连接酶缓冲液：500 mmol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH 7. 8) , 100 mmol/L Mg2+ , 10 mmol/L腺苷三磷酸(ATP) , 100 mmol/L DTT。

　　B.3 . 4 LB培养液。

　　B.3 . 5 氯仿-异戊醇(24 ∶ 1,体积比)。

　　B.3 . 6 大肠杆菌 DH5α(感受态)。

　　B.3.7 LB平板[含 β-半乳糖苷酶，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),氨苄青霉素]。

　　B.4 实验步骤

　　B.4 . 1 长时程过量酶切

　　称取 10 μg 高纯 CCC pUC19 DNA 置于一只微量离心管，加入 20 μL 10 × BamH I 缓冲液和150 μL水，充分混匀后平均分成 A 和 B两管;A管加入 5 μL BamH I(50 U~100 U)和 5 μL水;B管加入 5 μL BamH I(50 U~100 U)和 5 μL BST DNA 聚合酶(1 μg/μL)。混匀后置于 37 ℃水浴槽，1 h 后

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　　各取出 40 μL,其中 20 μL(标记 A1 号和 B1 号)待电泳检测，另 20 μL(标记 A2 号和 B2 号)待连接及蓝白斑计数;所剩 60 μL 继续酶切达 10 h 以上，又将它各均分为 3 管，分别标记 A3 、B3 、A4 、B4 、A5 、 B5 号 。

　　B.4 . 2 电泳

　　B.4 . 2 . 1 取出 A1 、B1 、A3、B3 号管，加入载样缓冲液，准备电泳检测。

　　B.4 . 2 . 2 1 . 5%琼脂糖，电泳电压 5 V/ cm~ 10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

　　B.4 . 3 连接

　　B.4 . 3 . 1 回收 DNA

　　取出 A2、B2、A4、B4、A5、B5 号管，各加入 20 μL 氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白，再沉淀出 DNA,并真空干燥样品。

　　B.4 . 3 . 2 连接反应

　　每管加入 2 μL 10 × T4 DNA连接酶缓冲液，2 U T4 DNA连接酶，加入水达总体积 20 μL,混匀后置于 15 ℃水浴槽 8 h。

　　B.4 . 3 . 3 转化与铺板

　　B.4 . 3 . 3 . 1 将感受态菌液加入含连接处理过的 DNA 的微量离心管内，轻混，置于 4 ℃冰浴槽 0 . 5 h以上。

　　B.4 . 3 . 3 . 2 将上述 6 只微量离心管移到 42 ℃水浴中热击 2 min, 迅即取出再置于 4 ℃冰浴槽 0 . 5 h以上。

　　B.4 . 3 . 3 . 3 向上述 6 只微量离心管各加入 1 mL LB培养液，轻混，置于 37 ℃水浴槽 1 h。

　　B.4 . 3 . 3 . 4 将 18 块固态 LB板，分别标上 A2、B2、A4、B4、A5、B5 号，每号均有 3 块板;在超净工作台铺板，每板加入上述菌液 200 μL;待板上菌液不会流动时，翻转平板，置于 37 ℃恒温培养箱 8 h 以上。

　　B.4 . 3 . 3 . 5 计算每块板蓝白斑数量，再算出每号管对应的每个处理的蓝白斑总数及百分比。

　　B.5 结果判定

　　在电泳板上，A1 、B1、A3、B3 号的谱带没有明显差异，说明长时程过量酶处理对 DNA 没有造成额外的切割。 B2、B4、B5 号和 A2、A4、A5 号的白斑总数与其蓝斑总数相比，若比值小于 1/9,则判定样品不含核酸外切酶;若比值大于或等于 1/9,则判定样品含有核酸外切酶。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)核酸内切酶检测

　　C.1 原理

　　pUC19 质粒为环状结构，核酸内切酶能破坏环状结构，两者电泳谱带不一致。

　　C.2 仪器

　　C.2. 1 电泳仪，备电泳槽。

　　C.2.2 分析天平(万分之一)。

　　C.2.3 紫外透光分析仪。

　　C.3 实验步骤

　　C.3. 1 pUC19 质粒反应

　　C.3. 1 . 1 在测试管里先后加入 4 μL pUC19 质粒 DNA(1 μg/μL)、14 μL水、2 μL酶，振荡器混匀，水浴1 h 。

　　C.3. 1 .2 在对照管里先后加入 4 μL pUC19 质粒 DNA(1 μg/μL)、16 μL水，振荡器混匀，水浴 1 h。

　　C.3 . 2 电泳

　　1%~1 . 5%琼脂糖凝胶，电泳电压 5 V/cm~10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

　　C.4 结果判定

　　在电泳板上，肉眼观察。 若测试管和对照管的谱带一致，则判定样品中不含有内切酶;若不一致，则判定样品中含有内切酶。