GB/T 34801-2017 脱氧核糖核酸酶活力检测方法

　　ICS 07 . 080 A 2 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 34801—2017

　　脱氧核糖核酸酶活力检测方法

　　Determinationoftheactivityofdesoxyribonuclease

　　2017-1 1-01 发布 2018-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 34801—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由中国标准化研究院提出并归口 。

　　本标准起草单位：中国标准化研究院、厦门市格灵生物技术有限公司、福建赛福食品检测研究所有限公司、浙江工商大学、河北农业大学、合肥工业大学、河北省出入境检验检疫局、北京市食品科学研究院、河北食品检验研究院、东营市标准化信息所、河南大学。

　　本标准主要起草人：马爱进、陈智勇、黄秀娟、王彦波、孙纪录、郑磊、刘道亮、孙勇、云振宇、傅玲琳、吴琦、赵琳、周魏、刘鹏、康文艺、宗学花。

　　GB/T 34801—20 17

　　脱氧核糖核酸酶活力检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了脱氧核糖核酸酶活力检测原理、仪器设备及器具、主要试剂、分析步骤和结果分析。本标准适用于生化试剂脱氧核糖核酸酶活力检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　脱氧核糖核酸酶 deoxyribonuclease;DNase

　　水解脱氧核糖核酸(DNA)中磷酸二酯键，生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶。

　　3.2

　　脱氧核糖核酸酶活力单位 ribonuclease activity unit

　　以浓度为 0.15 mg/mL 的 1.5 mL小牛胸腺 DNA 为底物，在 35 ℃且 pH 5.0 的条件下，1 min 内使反应液在 260 nm处的吸光度增加 0 . 001 所需要的酶量。

　　注：一个酶活力单位以 U表示。

　　4 原理

　　脱氧核糖核酸酶催化脱氧核糖核酸分解，降解产物在 260 nm 波长下具有特征吸收峰，通过外标法计算脱氧核糖核酸酶的活力。

　　5 仪器设备及器具

　　5 . 1 恒温水浴槽：精度为 0 . 1 ℃ 。

　　5 . 2 紫外-可见分光光度计：吸光度精确至 0 . 001 。

　　5.3 pH 计：精度为 0.01。

　　5 . 4 1 cm 石英比色皿。

　　5.5 电子天平：精度为 0.000 1 g、0.01 g 或 0.1 g。

　　6 主要试剂

　　本方法所用试剂均为分析纯，除特殊说明外，实验用水均为 GB/T 6882 规定的二级水。

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　　6. 1 0. 1 mol/L 乙酸-乙酸钠(CH3COOH-CH3COONa，HAC-NaAC)缓冲液，PH5.0

　　称取 8.2 g NaAc,精确至 0.01 g,0.45 g不含有结晶水的 MgCl2 ,0.21 g无水 CaCl2 溶于水中，缓慢加入 HAc 调 pH 至 5.0,混匀后定容至 1 000 mL。

　　6 . 2 0 . 15 mol/L 氯化钠(NaCl)溶液

　　称取 8.77 g NaCl溶于水中，混匀后定容至 1 000 mL。

　　6 . 3 小牛胸腺脱氧核糖核酸

　　来源于小牛胸腺，含量 ≥98%。

　　7 分析步骤

　　7 . 1 环境要求

　　所有试验操作均应在洁净的无外源 DNA酶环境中进行。

　　7 . 2 试验溶液的制备

　　7 . 2 . 1 小牛胸腺 DNA溶液

　　称取小牛胸腺 DNA0 . 015 g,精确至 0 . 000 1 g,溶于水中，使其溶液浓度为 0 . 15 mg/mL,现配现用。

　　7 . 2 . 2 固体样品待测酶液制备

　　根据标称，称取固体待测样品适量，溶于水中，调节脱氧核糖核酸酶活力在 10 U/mg~200 U/mg。

　　7 . 2 . 3 液体样品待测酶液制备

　　根据标称，用水调节待测液体样品的脱氧核糖核酸酶活力在 10 U/mL~200 U/ mL。

　　7 . 3 酶促反应

　　同一样本取 4 只离心管，设置空白对照管 1 只，检测管 3 只，其中空白管中依次加入小牛胸腺脱氧核糖核酸溶液 1 . 5 mL、水 0 . 5 mL 与 HAc-NaAc缓冲液 1 mL;检测管中依次加入小牛胸腺脱氧核糖核酸溶液 1 . 5 mL、待测酶液 0 . 5 mL 以及 HAc-NaAc缓冲液 1 mL。 每个待测酶液设定 3 个重复即 3 个检测管，35 ℃ ± 1 ℃恒温水浴反应时间为 10 min。

　　7 . 4 分光光度分析

　　空白对照管标记为 0 号管，检测管分别标记为 1 ~3 号管，加样方法如表 1 所示，反应后在 260 nm处测定对照管和检测管溶液的吸光度并记录记结果。

　　表 1 待测样液加样方法

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　　8 结果分析

　　8 . 1 酶活力计算 按式(1)计算：

　　犆 …………………………( 1 )

　　式中：

　　犆 —脱氧核糖核酸酶活力，U/mL或 U/mg;

　　Δ犃260 —检测管与空白对照管在 260 nm处测定得到的吸收值差;

　　犳 —稀释倍数;

　　1 000 — 吸光度原值与活力规定中规定吸光度 0 . 001 的换算系数;

　　10 — 反应时间与活力单位定义中的换算系数。

　　以平行样的平均值为最终的酶活力测定值，计算结果保留整数位。

　　8 . 2 定量限

　　本方法的定量限为 10 U/mL或 10 U/mg。

　　8 . 3 重复性

　　在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。