GB/T 34795-2017 谷氨酰胺转胺酶活性检测方法

　　ICS 07 . 080 G 66

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 34795—2017

　　谷氨酰胺转胺酶活性检测方法

　　Determinationoftheactivityoftransglutaminase

　　2017-1 1-01 发布 2018-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 34795—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。

　　本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、四川省卫生和计划生育监督执法总队、深圳市职业技术学院。

　　本标准主要起草人：张世伟、赖心 田、卢杰、王士峰、周李华、林霖、刘冬、唐栋、叶秀玲、兰全学、潘兰芳、杨国武。

　　GB/T 34795—20 17

　　谷氨酰胺转胺酶活性检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了茂原链轮丝菌(streptomycesmobaraensis)和天竺鼠(ca℃iaporcellus)来源的谷氨

　　酰胺转胺酶活性检测方法。

　　本标准适用于生化试剂、工业产品中谷氨酰胺转胺酶活性的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　谷氨酰胺转胺酶活性单位 transglutaminaseactivityunit

　　在 37 ℃、pH 6.0 时，每分钟可催化 N-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸(CBZ-Gln-Gly, CAS: 6610-42-0)和羟胺形成 1 . 0 μmol 的异羟肟酸盐所需的酶量为 1 单位，单位为 U。

　　4 原理

　　谷氨酰胺转胺酶能催化 N-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸和羟胺生成 L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸，L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸可以通过三氯化铁显色，在 525 nm 波长下具有特征吸收峰。 因此可以通过外标法计算 L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸的生成量测得酶活性。

　　5 仪器设备及器具

　　5. 1 pH 计：0.01 级。

　　5.2 电子天平：感量 0.000 1 g。

　　5 . 3 分光光度计。

　　5 . 4 1 cm 石英比色皿。

　　5 . 5 恒温水浴槽：控温精度 ±0 . 5 ℃ 。

　　5 . 6 离心机。

　　6 试剂

　　本标准所使用的试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 中规定的二级水。

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　　6. 1 Tris-Hcl缓冲液(PH 6.0 ,0.2 mol/L)

　　称取 12.114 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris),溶解在 450 mL水中，使用 1 mol/L 盐酸调节 pH 至 6.00 ±0 . 05,转入 500 mL容量瓶中，定容并摇匀。

　　6 . 2 试剂 A

　　称取 1.000 g N-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸，0.695 g 羟胺盐酸盐 (Hydroxylamine hydrochloride) , 0.307 g还原型谷胱甘肽(GSH),溶解于 Tris-HCl缓冲液(pH 6.0 ,0.2 mol/L), 使用 1 mol/L 氢氧化钠调节 pH 至 6.00±0.05, 用 Tris-HCl缓冲液(pH 6.0 ,0.2 mol/L)定容至 100 mL。

　　6 . 3 3 mol/L 盐酸溶液

　　将 36 %~38 %盐酸与水按体积比 1 ∶ 3 稀释。

　　6 . 4 12%三氯乙酸(TcA)溶液

　　称取 12 . 00 g 三氯乙酸溶于 80 mL水中，定容至 100 mL。

　　6 . 5 5%三氯化铁(Fecl3)溶液

　　称取 5.00 g 三氯化铁溶于 0.1 mol/L HCl 中，定容至 100 mL。

　　6 . 6 试剂 B

　　由 6 . 3、6 . 4、6 . 5 所述溶液按体积比 1 ∶ 1 ∶ 1 混合，现配现用。

　　6 . 7 L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准储备液

　　称取 0.162 1 g 的 L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸 (L-Glutamic acid γ-monohydroxamate) ,用 10 mL 的Tris-HCl缓冲液 (pH 6. 0 , 0. 2 mol/L) 溶 解 后，转 移 至 100 mL 的 容 量 瓶 中，用 Tris-HCl 缓 冲 液(pH 6.0 ,0.2 mol/L)定容并摇匀。

　　7 分析步骤

　　7 . 1 标准曲线的绘制

　　分别移取 L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准储备液 0 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL 和 4.0 mL 到10 mL 的容量瓶中，再用 Tris-HCl 缓冲液定容至刻度，摇匀，L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸的浓度分别是

　　0 μmol/mL、0.2 μmol/mL、0.5 μmol/mL、1.0 μmol/mL、2.0 μmol/mL 和 4.0 μmol/mL。取 1 mL试剂A 与 0.4 mL不同浓度的 L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液混合，37.0 ℃ ±0.5 ℃水浴 10 min,加 0.4 mL试剂 B终止反应。 使用 1 cm 的石英比色皿，以 L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸浓度为 0 μmol/mL 的标准溶液反应液作空白，在 525 nm处测定每个稀释液的吸光度。 以 L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸浓度为横坐标，以稀释液的吸光度为纵坐标做标准曲线，以最小二乘法得出线性回归方程。 相关系数应在 0 . 999 0 以上时方可使用，否则需重做。

　　7 . 2 试验液的制备

　　称取样品 0.1 g,精确至 0.000 1 g, 用 Tris-HCl缓冲液(pH 6.0 , 0.2 mol/L) 溶解后，转移至合适容量瓶中并定容，使得最后的溶液中含有 0 . 17 U/mL~0 . 23 U/ mL 的酶活力。

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　　7 . 3 测定

　　取 1 mL试剂 A 与 0.4 mL试验液混合，37.0 ℃ ±0.5 ℃水浴 10 min,加 0.4 mL试剂 B终止反应。另取一只试管加入试验液，于 95 ℃ ~100 ℃水浴加热 10 min后，以 5 000 r/min 离心 10 min。取该上清液 0 . 4 mL, 37 ℃水浴 10 min,加 0 . 4 mL试剂 B终止反应，作为空白对照。 用 1 cm 的石英比色皿，在 525 nm处测样品试验液和空白液的吸光度。 样品试验液和空白液的吸光度之差即 ΔA，将 ΔA 带入标准曲线线性回归方程计算试验液中 L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸的浓度 c。

　　8 结果

　　8 . 1 结果计算见式(1) 。

　　X ……………………( 1 )

　　式中：

　　X —谷氨酰胺转胺酶活性，单位为酶活力单位每克(U/g) ;

　　c —为 0 . 4 mL 试 验 液 中 生 成 的 L-谷 氨 酸-γ-单 异 羟 肟 酸 浓 度，单 位 为 微 摩 尔 每 毫 升

　　(μmol/mL),从标准曲线中得出;

　　V —为样品溶解液体积，单位为毫升(mL) ; d —为样品稀释倍数;

　　m —为样品质量，单位为克(g) ;

　　10 —为反应时间，单位为分钟(min) 。

　　计算结果保留三位有效数字。

　　8 . 2 重复性

　　在重复性条件下获得的两次独立性测定结果差值的绝对值不得超过算术平均数的 10%。