GB/T 31789-2015 冬生疫霉菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31789—2015

　　冬生疫霉菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofPhytophthorahibernalisCarne

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31789—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :杜洪忠 、吴品珊 、王宏毅 、严进 、张秋娥 。

　　冬生疫霉菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了冬生疫霉菌的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于针对冬生疫霉菌寄主的苗木 、枝条 、枝叶 、果实以及夹带土壤和介质中冬生疫霉菌的鉴定 。

　　2 仪器和用具

　　2. 1 仪器

　　生物显微镜 、超净工作台 、光照培养箱 、电子天平(1/1 000 g) 、高压灭菌锅 、冰箱 、PCR 扩增仪 、荧光PCR扩增仪 、电泳仪 、凝胶成像仪 、高速冷冻离心机 、恒温水浴锅 。

　　2.2 用具

　　烧杯 、三角瓶 、量筒 、试管 、培养皿 、酒精灯 、镊子 、剪刀 、解剖刀 、接种针 、载玻片 、盖玻片 、塑料研杵 、移液器 、移液器吸头 、离心管 、液氮罐 。

　　3 试剂、材料和培养基

　　3. 1 试剂

　　匹马霉素(pimaricin) ,氨苄青霉素钠盐(ampicillin) , 利福平钠盐(rifampicin) , 五氯硝基苯(penta- chloronitrobenzene) ,碳酸钙(CaCO3 ) ,β-谷 甾 醇(β-sitosterol) , 色 氨 酸(tryptophan) , 硫 氨(thiamine) ,氯化钙(CaCl2 · H2 O) ,次氯酸钠(NaClO) 。

　　琼脂糖 ,Tris-HCl,MgCl2 , HCl,EDTA(乙 二 胺 四 乙 酸 四 钠 盐) , NaOH , NaOAc, KCl, Tris, CTAB (十六烷基三甲基溴化铵) ,TAE,无水乙醇(Ethanol) ,三氯甲烷(Chloroform) ,异丙醇(Isopropanol) ,异戊醇(Isoamylalcohol) ,SYBR Green I核酸染料 ,蛋白酶 K,Taq DNA 聚合酶 ,dNTPs,DNA相对分子质量标准物 ,PCR 引物 PHIB1 和 PHIB2, 实 时 荧 光 PCR 引 物 PH-F 和 PH-R 及 TaqMan-MGB探 针PH-Pr。

　　3.2 材料

　　琼脂粉 、V8汁 、雪松松针(Cedrusdeodara) 、柑橘叶片(Citrus spp.) 、胡萝 卜 、玉米油 。

　　3.3 培养基

　　V8培养基 、胡萝 卜 丝 培 养 基 CPA、选 择 性 培 养 基 PARP-V8和 卵 孢 子 培 养 基 , 具 体 配 方 参 见 附录 B。

　　4 检疫鉴定方法

　　4. 1 症状检查

　　重点观察柑橘果实是否有褐色病变 , 叶和小枝是否枯萎 ;杜鹃属植物 ,观察叶片是否有深褐色病斑 ,

　　GB/T 31789—2015

　　或整个叶片和叶柄变褐 ;参见附录 A。玫瑰受害症状为叶部和小枝枯萎 ,茎基部有深紫色到黑色病斑 ;其他寄主上为根部腐烂或溃疡 。

　　4.2 分离培养和诱集

　　4.2. 1 寄主组织分离培养

　　可疑症状的根、茎、叶、果实用流水冲洗表面约 15min,在病健交界处或变色部位切取边长为 5 mm× 5 mm的样品,灭菌滤纸吸干水分 ,放于选择性培养基 PARP-V8上 , 或用 0. 5 %次氯酸钠消毒 2 min~ 5 min,无菌水冲洗 3 次 ,灭菌滤纸吸干水分 ,放于胡萝 卜丝培养基或稀释 5倍或 10倍的 V8培养基上 。

　　培养皿 16 ℃ ~ 20 ℃黑暗培养 4 d~ 6 d,如有真菌菌落出现 ,转到 V8培养基上纯化 , 16 ℃ ~ 20 ℃黑暗培养 。

　　4.2.2 土壤和介质诱集

　　称取 25 g 土壤或介质 ,碾碎 、去杂放入灭菌烧杯中 ,加入无菌水将土壤或介质润湿(无游离水) ,保鲜膜封 口 ,置于 16 ℃ ~ 20 ℃黑暗放置 。

　　3 d~ 5 d后在烧杯中加入灭菌水 ,使水层高 4. 0 cm。取雪松松针或柑橘叶片 ,无菌水清洗后漂放在水面或浸在水中 ,16 ℃ ~ 20 ℃黑暗放置 。

　　2 d~ 3 d后开始检查 ,取有失绿或变色的松针或叶片 ,无菌水冲洗 ,灭菌滤纸吸干水分 ,放于选择性培养基 PARP-V8或胡萝 卜丝培养基上 , 16 ℃ ~ 20 ℃黑暗培养 。如有真菌菌落出现 ,转到 V8培养基上纯化 ,16 ℃ ~ 20 ℃黑暗培养 。

　　4.2.3 孢子囊培养

　　取纯化后菌落边缘菌丝块 ,置于盛有 10 mL无菌水的培养皿中 ,16 ℃ ~ 20 ℃黑暗条件下诱发孢子囊 ,48h后观察菌丝块周围孢子囊产生情况 。

　　4.2.4 卵孢子培养

　　将分离菌转至卵孢子培养基上 ,7 ℃ ~ 8 ℃培养 1周 ~ 2周 ,观察是否有卵孢子形成 。 4.3 分子生物学检测

　　4.3. 1 DNA提取

　　收集分离到的真菌菌丝 ,采用 CTAB法提取核酸 。参见附录 C。

　　4.3.2 PCR检测

　　采用引物 PHIB1和 PHIB2的特异性 ,检测从病菌基因组 DNA 中 PCR扩增到的基因片段 。

　　特异性引物 PHIB1和 PHIB2 的 序 列 分 别 为 5'-TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3'和 5'-CT- TCCACAACCAATTCCATTATGC-3'。

　　反应体系(25μL) :样品 DNA 1 μL,10×PCR缓冲液 2. 5 μL,25 mmol/LMgCl2 2 μL,2. 5 mmol/L dNTPs2 μL,10 μmol/L引物各 0. 5 μL,5 U/μLTaq DNA 聚合酶 0. 2 μL,ddH2 O 16. 3 μL。

　　反应条件为 94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35个循环;72 ℃ 10 min;4℃保存 。

　　在 1×TAE 电泳缓冲液中 ,1. 5%琼脂糖(含 SYBR Green Ⅰ 核酸染料)凝胶电泳 ,5 V/cm ,凝胶成像仪分析结果 。

　　4.3.3 实时荧光 PCR检测

　　可以选择荧光 PCR检测 。

　　实时荧 光 PCR 引 物 序 列 为 PH-F: 5'-CGACTTGCCACCGGGA-3'和 PH-R: 5'-AACGGTACTT CTCTTTGCTCGAA-3',TaqMan-MGB探 针 PH-Pr:5'-(FAM) TTCCACAACCAATTCCAT (NFQ- MGB)-3',探针 5'端标记的荧光报告基团为 FAM ,3'端标记的非荧光猝灭基团为 MGB。

　　反应体系(25μL) :样品 DNA 1 μL,10×PCR缓冲液 2. 5 μL,25 mmol/LMgCl2 2 μL,2. 5 mmol/L dNTPs2 μL, 10 μmol/L引 物 各 1 μL, 10 μmol/L 探 针 PH-Pr 1. 5 μL, 5 U/ μL Taq DNA 聚 合 酶0. 5 μL,ddH2 O 13. 5 μL。

　　反应循环为 94 ℃ 10 min;94 ℃ 15 s,56 ℃ 60 s,循环 40次 。

　　5 鉴定特征

　　5. 1 菌落特征

　　冬生疫霉菌在 V8培养基上生长速度较慢(4 mm/d~ 8 mm/d) ,菌落白色 ,平贴至中度的蓬松 ,呈玫瑰花瓣状 ,花瓣状区域较宽且圆 ,V8培养基淡橘黄色 。参见附录 D。

　　5.2 病菌形态

　　冬生疫霉菌的孢子囊长卵圆形或椭圆形 ,易脱落 ,顶部具有不完全的乳头状突起 ,通常基部锥形 、顶部近半乳突处最宽 。

　　孢子囊大 小(29 μm~ 53 μm) × (14 μm~ 22 μm) , 长 宽 比 较 大 , 为 1. 8~ 2. 4, 孢 囊 柄 长 23 μm~ 73μm。

　　孢囊梗不分枝或窄的长分枝 ,或形成不规则合轴式长侧枝 。孢子囊低温萌发释放游动孢子 。病菌不产生厚垣孢子 ,一般无菌丝膨大体 。

　　该菌为同宗配合 ,雄器多围生 ,偶侧生 ,平均 10 μm×15 μm;卵孢子黄橙色 ,满器 , 大小为 22 μm~ 45. 6 μm ,壁厚 1 μm~ 3 μm;藏卵器大小为 22 μm~ 56μm。

　　孢子囊 、雄器和卵孢子形态图参见附录 D。

　　5.3 与近似种的形态区别

　　冬生疫霉菌与丁香疫霉菌(Phytophthora syringae)在形态上很相似 , 主要区别为冬生疫霉菌落的花瓣区域较宽 ,孢子囊易脱落 ,雄器多围生 ; 丁香疫霉菌落的花瓣区域较尖 、窄 ,孢子囊不脱落 ,雄器多侧生 ,有菌丝膨大体 。参见附录 E。

　　5.4 PCR特异性产物

　　引物 PHIB1和 PHIB2的特异性 PCR扩增目的片段为 407bp。

　　5.5 实时荧光 PCR检测

　　若阴性对照及空白对照的 Ct值 ≥40,供试菌 Ct值 ≤36,可判定为阳性 。

　　6 结果判定

　　病菌的培养性状和形态特征与 5. 1 和 5. 2 的描述一致 ,且 PCR检测结果或实时荧光 PCR检测结果呈阳性 ,可判定为冬生疫霉菌 。

　　7 样品和档案保存

　　7. 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存 。对检出冬生疫霉菌的样品应保存于 10℃冰箱中 ,至少保存6个月 , 以备复核 。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 。

　　7.2 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为冬生疫霉菌的菌株 ,应妥善保存 。将菌株接种于 PDA 培养基斜面上 , 20 ℃培养 5 d,10 ℃黑暗条件下保存 ,定期(60d)转接防止病菌死亡 ,至少保存 6 个月 。保存期满后高压灭菌灭活处理 。

　　7.3 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并应有实验人员和审核人员签字 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　冬生疫霉菌相关信息

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 病菌的基本信息

　　英文名 :Citrus fruitbrown rot,Citrus leaf blight

　　学名 :PhytophthorahibernalisCarne

　　分类地位 :藻菌界(Chromista) ,卵菌门(Oomycota) ,霜霉纲(Peronosporea) ,霜霉 目 (Peronospora- les) ,霜霉科(Peronosporaceae) ,疫霉属(Phytophthora) 。

　　传播途径 :主要通过感病寄主 、土壤和雨水进行传播扩散 。

　　近似种 :与冬生疫霉菌在形态上较为近似的是丁香疫霉菌(Phytophthora syringae) 。

　　A. 1.2 方法原理

　　根据冬生疫霉菌的形态学特征和目标片段的序列特征为鉴定依据 。

　　A.2 寄主范围

　　病菌主要为害柑橘属(Citrus spp.)植物 ,如甜橙 、橘子 、胡柚 、柠檬等 ,引起果实褐腐 ;还可侵染甜椒(Capsicum annuum L. ) 、番 茄 (Lycopersicon esculentum L. ) 、茄 子 (Solanum melongena L. ) 、苹 果(Maluspumila Mill.) 、玫 瑰(Rosa sp.) 、杜 鹃 属(Rhododendron) 、芝 麻(Sesamum indicum L. ) 、红 花(Carthamustinctorius L. ) 、贝 壳 杉(Agathisaustralis Salisb. ) 、白 雪 松(Chamaecyparis lawsoniana)等 ,造成枯萎 、根腐或溃疡 。

　　A.3 病害症状

　　冬生疫霉菌可导致柑橘属植物果实褐腐 , 叶部和小枝呈枯萎症状 。侵染初期 ,果实表皮出现浅褐色变色 ,感染部位皮质坚硬 ,湿度适合时长出白色菌丝体(参见图 A. 1) 。受害果实味苦 、具腐臭味 。

　　杜鹃属植物受害的症状为叶片出现深褐色至黑色到卵形或圆形病斑 ,病斑可扩展到整个叶片直至叶柄(参见图 A. 2) 。

　　玫瑰受害症状为叶部和小枝呈现枯萎 ,茎基部有深紫色到黑色病斑 ,病斑处组织深褐色到黑色 。

　　冬生疫霉还可导致苹果 、番茄 、茄子 、红花和芝麻根部腐烂 ,贝壳杉 、白雪松出现溃疡症状 。

　　注 : 引 自 Courtesy L. W. Timmer。

　　图 A. 1 柑橘属果实症状

　　注 : 引 自 CherylBlomquist。

　　图 A.2 杜鹃属植物受害症状

　　A.4 地理分布

　　以色列 、土耳其 、南非 、法国 、英国 、西班牙 、希腊 、意大利 、葡萄牙 、美国 、阿根廷 、委内瑞拉 、特立尼达和多巴哥 、澳大利亚 、新西兰 、斐济 。

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　培养基

　　B. 1 V8培养基

　　V8汁 100 mL,加入 2. 5 g碳酸钙 ,15 g琼脂 ,蒸馏水 900 mL,85%乳酸调节 pH 至 7. 2,灭菌 。

　　B.2 胡萝 卜丝培养基 CPA

　　50 g胡萝 卜切丝 ,15 g琼脂 ,1 000 mL蒸馏水 ,85%乳酸调节 pH 至 7. 2,灭菌 。

　　B.3 选择性培养基 PARP-V8

　　V8汁 50 mL, 加 入 1. 25 g 碳 酸 钙 , 15 g 琼 脂 , 950 mL 蒸 馏 水 , 121 ℃ , 灭 菌 20 min后 , 冷 却 到50 ℃ ,加入匹马霉素 0. 005 g,氨苄青霉素钠盐 0. 25 g,利福平钠盐 0. 01 g,五氯硝基苯 0. 025 g。

　　B.4 卵孢子培养基

　　V8汁经 4000 r/min离心 20min,取上清液 177mL,加入 0. 03g阝-谷甾醇 、0. 02g色氨酸 、0. 1 g氯化钙 、0. 001 g硫氨和 15g琼脂 ,加入蒸馏水至 1 000 mL,灭菌后冷却到 50 ℃ 。

　　附 录 C (资料性附录) DNA提取方法

　　将刮取菌落上的菌丝体放入 1. 5 mL浸在液氮里的离心管中 ,用塑料杵碾碎待用 。

　　离心管加入 300 μL~ 500 μLCTAB缓冲液(其中含 0. 1 g蛋白酶 K)混匀 ,65 ℃水浴 1 h;13000g离心 5 min~ 10 min,保留上清液 ;加 500 μL三氯甲烷 ∶ 异戊醇(体积比为 24 ∶ 1) 混匀 , 13 000 g 离心5 min~ 10 min, 保 留 上 清 液 ; 再 加 500 μL三 氯 甲 烷 ∶ 异 戊 醇(体 积 比 为 24 ∶ 1) 混 匀 , 13 000 g 离 心5 min~ 10 min,保留上清液 ;加入 1 mL异丙醇混匀 , -20 ℃过夜;13000g 离心 30min,可见 DNA沉淀 ;70%乙醇洗 DNA沉淀 ,室温干燥 ;用 30 μL~ 50 μLTris-EDTA缓冲液溶解 DNA,待用 。

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　冬生疫霉菌形态图

　　图 D. 1 V8培养基上菌落形态

　　图 D.2 孢子囊 图 D.3 雄器、藏卵器和卵孢子

　　附 录 E

　　(资料性附录)

　　冬生疫霉菌与丁香疫霉菌的形态区别

　　表 E. 1 冬生疫霉菌与丁香疫霉菌的形态区别

　　参 考 文 献

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