GB/T 31730-2015 水稻中转基因成分测定 膜芯片法

　　ICS 67. 050 X 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31730—2015

　　水稻中转基因成分测定 膜芯片法

　　Detection ofgenetically modified componentsin rice—

　　Membrane-based array method

　　2015-06-02发布 2015-09-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31730—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由中国标准化研究院归 口 。

　　本标准起草单位 : 四川华汉三创生物科技有限公司 、中国标准化研究院 、黑龙江省粮油卫生检验监测站 。

　　本标准主要起草人 :黄广平 、云振宇 、尹志坚 、胡太贵 、孙昭 、张瑶 、王勇强 、董玖红 、宋廷瑞 、张金龙 、刘贞 。

　　水稻中转基因成分测定 膜芯片法

　　1 范围

　　本标准规定了水稻及水稻加工产品中转基因成分的检测方法 。

　　本标准适用于转 BAR基因耐除草剂水稻和转 Bt基因(Cry1Ab/Cry1Ac) 抗虫水稻中转基因成分的快速定性检测 ,也适用于水稻加工产品中以上成分的快速定性检测 。

　　本标准规定的转基因成分最低检测限量是 1 g/kg。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 19495. 1 转基因产品检测 通用要求和定义

　　GB/T 19495. 2 转基因产品检测 实验室技术要求

　　GB/T 19495. 3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法

　　GB/T 19495. 6 转基因产品检测 基因芯片检测方法

　　GB/T 19495. 7 转基因产品检测 抽样和制样方法

　　3 术语、定义和缩略语

　　3. 1 术语和定义

　　GB/T 19495. 1、GB/T 19495. 6界定的术语和定义适用于本文件 。

　　3.2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)

　　dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)

　　dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)

　　dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)

　　dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)

　　dUTP:脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate)

　　bp:碱基对(base pair)

　　BAR:草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene)

　　Cry1Ab:苏 云 金 芽 孢 杆 菌 杀 虫 毒 蛋 白 cry1A(b) 基 因 [Bacillus thuringiensis insecticidal toxin cry1A(b) gene]

　　Cry1Ac:苏云金 芽 孢 杆 菌 杀 虫 毒 蛋 白 cry1A(c) 基 因 [Bacillus thuringiensis insecticidal toxin cry1A(c) gene]

　　GB/T 31730—2015

　　CaMV35S-P:花椰菜花叶病毒的 35S启动子(promoter from cauliflower mosaic virus)

　　NOS-3’:胭脂碱合成酶基因终止子(termination sequence of thenopaline synthase gene)

　　CaMV35S-T:花椰菜花叶病毒的 35S终止子(termination sequencefrom cauliflowermosaicvirus)

　　GOS9:水稻 gos9基因[Oryza sativa(rice) gos9 gene]

　　PC: 阳性对照(positive control)

　　NC: 阴性对照(negative control)

　　UNG酶 :尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)(uracilN-glycosylase)

　　Taq酶 :Thermusaquaticus DNA 聚合酶(Thermusaquaticus DNA polymerase)

　　AminolinkerC6:6个碳原子作为连接臂的氨基标记(C6Amino linker)

　　4 原理

　　根据转基因水稻中常见转基因片段和调控元件设计特异性多重 PCR 引物 ,对样本进行多重 PCR扩增 。PCR 引物上修饰有生物素 。若样本中出现目标片段而得到 PCR 扩增产物 ,PCR 产物与固定有目标基因特异性探针的膜芯片进行杂交 。杂交点上的生物素和碱性磷酸酶标记链霉亲和素反应 , 以及碱性磷酸酶化学显色底物进行化学显色 ,则可在杂交点上形成肉眼可见的杂交信号 。依据膜芯片上杂交点的显色情况 ,判断样本中是否含有待检转基因成分 ,检测结果可以用肉眼直接判断 ,或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果 。

　　5 试剂与标准品

　　5. 1 试剂

　　5. 1. 1 试剂组分

　　本标准中试剂组分和存放条件参见附录 A 和 5. 1. 2~ 5. 1. 4 的规定 。 除非另有规定 ,本方法中所用试剂均为分析纯 ,水为 GB/T 6682规定的二级水 。

　　5. 1.2 引物

　　PCR反应使用的引物序列应符合表 1 的规定 。

　　表 1 PCR反应使用的引物序列

　　表 1 (续)

　　5. 1.3 探针

　　膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表 2 的规定 。

　　表 2 目标基因探针序列

　　5. 1.4 其他试剂

　　5. 1.4. 1 碱性磷酸酶标记链霉亲和素(AP-streptavidin) 。

　　5. 1.4.2 碱性磷酸酶化学显色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT) 。

　　5. 1.4.3 磷酸二氢钠(NaH2PO4 · H2 O) 。

　　5. 1.4.4 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na,C10 H14N2Na2 O8 ) 。

　　5. 1.4.5 十二烷基磺酸钠(SDS,C12 H25SO3Na) 。

　　5. 1.4.6 氢氧化钠(NaOH) 。

　　5. 1.4.7 氯化钠(NaCl) 。

　　5. 1.4. 8 多 重 PCR 即 用 型 预 混 液 (Multiplex PCR Master Mix) : MgCl2 3 mmol/L, dATP、dCTP、 dGTP、dTTP和 dUTP各 0. 4 mmol/L,UNG酶 4×104 U/L,Taq酶 8×104 U/L。

　　5. 1.4.9 多重 PCR引物预混液(Multiplex PCR Primer Mix) :每条引物 2 μmol/L。

　　5. 1.4. 10 20×SSPE缓冲液 :3 mol/L NaCl,200 mmol/LNaH2PO4 ,20 mmol/L EDTA,pH7. 4。

　　5. 1.4. 11 去活化液 :100 mmol/L NaOH。

　　5. 1.4. 12 去活化清洗液 :2×SSPE,0. 1% SDS。

　　5. 1.4. 13 杂交液 :2×SSPE,0. 1% SDS。

　　5. 1.4. 14 杂交清洗液 :2×SSPE,0. 5% SDS。

　　5. 1.4. 15 酶孵育液 :2×SSPE,0. 5% SDS。

　　5. 1.4. 16 孵育清洗液 1:2×SSPE,0. 5% SDS。

　　5. 1.4. 17 孵育清洗液 2:2×SSPE。

　　5. 1.4. 18 底 物 显 色 液 : 碱 性 磷 酸 酶 化 学 显 色 底 物 NBT/BCIP, 含 0. 15 mg/mL BCIP, 0. 30 mg/mL NBT,100 mmol/LTris-HCl,5 mmol/LMgCl2 ,pH9. 5。

　　5.2 标准品

　　5. 2. 1 LLRice62Rice转基因水稻标准品 LLRice62品系 ,包含 BAR,CaMV35S-P,CaMV35S-T转基因成分 。

　　5.2.2 BT63Rice转基因水稻标准品 BT63品系 ,包含 Cry1Ab,Cry1Ac,NOS-3’转基因成分 。

　　5.2.3 Non-Modified Rice非转基因水稻标准品 。

　　6 仪器与设备

　　6. 1 基因扩增仪 。

　　6.2 核酸微量分光光度计 。

　　6.3 纯水仪 。

　　6.4 分析天平 :精确到 0. 001 g。

　　6.5 膜芯片识读仪 。

　　6.6 台式离心机 :转速 12 000 r/min。

　　6.7 分子杂交炉 。

　　6. 8 其他相关仪器和设备 。

　　7 试验方法和流程

　　7. 1 膜芯片检测流程

　　膜芯片法检测流程参见附录 B。

　　7.2 防污染措施

　　检测过程中防止交叉污染的措施应按照 GB/T 19495. 2 的规定执行 。

　　7.3 抽样和样品制备要求

　　7.3. 1 实验室抽样要求

　　实验室样品代表性应符合 GB/T 19495. 7 的规定 。

　　7.3.2 样品的保存

　　标准品 、实验室样品及测试样品的保存应按照 GB/T 19495. 1 的规定执行 。

　　7.3.3 样品的制备

　　所有测试样品的制备操作应按照 GB/T 19495. 2 的规定执行 ,小心操作确保防止任何的污染和样品组分的改变 。

　　7.3.4 DNA 的提取

　　样品中 DNA 的提取 ,应按照 GB/T 19495. 3 中的规定执行 , 或采用 同 等 功 能 的 植 物 基 因 组 DNA提取试剂盒 。并对提取后的样品 DNA进行定量 。每个测试样品提取时应做两个提取重复 。

　　7.3.5 PCR扩增

　　7.3.5. 1 PCR反应体系

　　按照表 3 配制 PCR 反应体系 。 每次实验中 , 利用转基因水稻标准品的基因组 DNA 作为阳性 质控 ,非转基因水稻标准品的基因组 DNA作为阴性质控 ,核酸提取空白作为空白质控 , 以对后续的 PCR扩增体系 、膜芯片杂交反应进行质控 。

　　表 3 PCR反应体系体积(50μL)

　　7.3.5.2 PCR反应循环参数

　　按照表 4设计 PCR反应参数 。

　　表 4 PCR反应参数

　　7.4 膜芯片杂交

　　7.4. 1 膜芯片制备

　　膜芯片制作和质量控制参见附录 C。

　　7.4.2 杂交体系

　　按照表 5 配制杂交体系液 。

　　表 5 杂交体系

　　7.4.3 酶孵育体系

　　按照表 6 配制酶孵育体系液 ,用前新鲜配制 。

　　表 6 酶孵育体系

　　7.4.4 杂交、酶联及显色

　　7.4.4. 1 杂交检测方式 :

　　本步骤有手动操作和自动杂交仪测定两种选择 。

　　7.4.4.2 手动过程 :

　　将膜芯片置于杂交盒内 ,按表 7进行手动杂交 。杂交过程在分子杂交炉中进行 ,类似仪器应满足实验要求 。

　　表 7 膜芯片手动杂交过程

　　7.4.4.3 自动杂交仪测定过程 :

　　具有自动杂交 、清洗反应功能的仪器 ,可以按照表 8 流程所示 ,依次自动完成去活化 、杂交 、清洗 、酶孵育 、显色等步骤 。

　　表 8 自动杂交仪测定过程

　　7.5 膜芯片结果判读

　　7.5. 1 目测判读

　　显色后的膜芯片可以用肉眼直接判读检测结果 。 阳性杂交信号为肉眼明显可见的蓝色斑点 。如果杂交点部位没有显色 ,和膜芯片背景相同 ,则判读为阴性杂交信号 。

　　7.5.2 膜芯片识读仪判读

　　膜芯片显色后 ,使用膜芯片识读仪进行扫描分析 ,根据杂交点的信号值判断检测结果 , 阳性杂交信号的判断阈值是 3倍背景信号值加上 3倍背景信号值标准差 。

　　8 结果判断

　　8. 1 质量控制

　　8. 1. 1 核酸提取空白对照和多重 PCR扩增试剂空白对照

　　膜芯片上内源基因探针点杂交信号阴性 ,转基因探针点杂交信号阴性 , 阳性对照探针点杂交信号阳性 , 阴性对照探针点杂交信号阴性 。

　　8. 1.2 非转基因标准品对照

　　膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性 ,转基因探针点杂交信号阴性 , 阳性对照探针点杂交信号阳性 , 阴性对照探针点杂交信号阴性 。

　　8. 1.3 转基因标准品对照

　　膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性 ,标准品中所含转基因探针点杂交信号阳性 , 阳性对照探针点杂交信号阳性 , 阴性对照探针点杂交信号阴性 。

　　8.2 膜芯片结果判读

　　8.2. 1 样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阴性 , 表明未能从样本中提取出适宜多重 PCR 扩增的核酸模板 ,需要重新进行样本核酸提取和多重 PCR扩增 。

　　8.2.2 样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性 ,转基因探针点杂交信号阴性 ,表明样本核酸提取 、多重 PCR扩增和膜芯片杂交过程正常 ,判断样本中未检出测定转基因成分 。

　　8.2.3 样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性 ,各转基因探针点杂交信号部分或全部阳性 ,表明样本核酸提取、多重 PCR扩增和膜芯片杂交过程正常 ,判读样本中存在阳性信号点对应的转基因成分 。

　　8.2.4 膜芯片杂交检测结果应符合 8. 1. 1~ 8. 1. 3对照情况 。否则应判断实验不成功 ,需重做实验 。

　　9 结果表述

　　9. 1 未检出

　　在阴性质控探针杂交点 、阳性质控探针杂交点检测结果正常的情况下 ,未检出本标准所包括的转基因成分 。

　　9.2 检出

　　检出 × × × ×基因 , 阴性质控探针杂交点 、阳性质控探针杂交点的检测结果正常 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　膜芯片法试剂组分和存放条件

　　膜芯片法试剂组分和存放条件参见表 A. 1。

　　表 A. 1 膜芯片法试剂组分和存放条件

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　膜芯片法检测流程

　　膜芯片法检测按照图 B. 1 流程进行 。

　　图 B. 1 膜芯片法检测流程

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　膜芯片制作与质量控制

　　C. 1 膜芯片制作

　　采用微定量喷点式膜芯片点样仪 ,将各个核苷酸探针(探针浓度 25 μmol/L) 分布在带负电荷尼龙膜芯片上的特定位置区域 。芯片表面包被的探针布局如图 C. 1所示 。

　　杂交阳性对照 :PC,监测芯片杂交过程是否正常 。

　　内对照 :GOS9,指膜芯片上 用 来 质 控 PCR 扩 增 过 程 是 否 正 常 的 对 照 , 使 用 水 稻 特 异 性 内 源 基 因gos9扩增片段互补的一段寡核苷酸作为探针 。

　　阴性对照 :NC,指膜芯片上用来质控探针杂交特异性的对照 。一般使用一段与任何靶标分子序列无关的寡核苷酸作为探针 。

　　图 C. 1 膜芯片探针布局

　　C.2 膜芯片的质量控制

　　膜芯片点样后扫描无漏点 、连点 ,位点规则 , 大小均匀一致 ,点与点的距离为 300 μm~ 500 μm;杂交后阳性质控实验杂交信号清晰可见 。