GB/T 18246-2019 饲料中氨基酸的测定

　　ICS 65 . 120 B 46

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 18246—2019

　　代替 GB/T 18246—2000

　　饲料中氨基酸的测定

　　Determinationofaminoacidsinfeeds

　　2019-12-10 发布 2020-07-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 18246—2019

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准代替 GB/T 18246—2000《饲料中氨基酸的测定》。

　　本标准与 GB/T 18246—2000 相比，除了编辑性修改外，主要技术内容变化如下：

　　— 修改了标准的适用范围，增加了精料补充料，明确了不同处理方法所测定的氨基酸种类，增加了各种氨基酸的摩尔质量和定量限(见第 1 章和附录 A, 2000 年版的第 1 章)。

　　— 将标准方法分四章表述，分别为“常规酸水解法”“氧化酸水解法”“碱水解法”“酸提取法”(见第3 章、第 4 章、第 5 章、第 6 章)。

　　— 修改了常规酸水解法盐酸水解溶液配方(见 3 . 2 . 3 , 2000 年版的 4 . 1 . 1 . 1) 。

　　— 增加了氧化酸水解测定含硫氨基酸以外其他氨基酸的方法(见 4 . 2) 。

　　— 修改了盐酸提取溶液配方(见 6 . 2 . 3 , 2000 年版的 4 . 3 . 1) 。

　　— 增加了酸提取法中配合饲料、浓缩饲料和精料补充料样品的净化步骤(见 6 . 5 . 1 . 2 , 2000 年版的7 . 1 . 3) 。

　　— 修改了试验数据处理中的计算公式[见式(1)、式(3) , 2000 年版的式(1)、式(2)] 。

　　— 修改了精密度的表述(见 3 . 7、6 . 7 , 2000 年版的第 9 章)。

　　— 修改了附录 A 的内容，修改为各种氨基酸的摩尔质量和定量限(见附录 A, 2000 年版的附录A) 。

　　— 增加了氨基酸标准溶液色谱图(见附录 B) 。

　　本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC 76)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心(北京)]。

　　本标准主要起草人：贾铮、赵根龙、李兰、樊霞、肖志明、李阳、刘晓露。

　　本标准的历次版本发布情况为：

　　—GB/T 18246—2000 。

　　GB/T 18246—2019

　　饲料中氨基酸的测定

　　1 范围

　　本标准规定了饲料中总氨基酸(肽键结合和游离的)和游离氨基酸(天然和添加的)测定方法，包括常规酸水解法、氧化酸水解法、碱水解法和酸提取法。

　　常规酸水解法适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸)和色氨酸以外的其他氨基酸(天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸)含量的测定。

　　氧化酸水解法适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)的测定。 以偏重亚硫酸钠为氧化终止剂时，可测定除酪氨酸、色氨酸以外的其他蛋白水解氨基酸;以氢溴酸为终止剂时，可测定除酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和色氨酸以外的其他蛋白水解氨基酸。

　　碱水解法适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中色氨酸的测定。

　　酸提取法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中游离氨基酸的测定。

　　各氨基酸的定量限见附录 A 中表 A. 1 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 15399 饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法

　　GB/T 15400 饲料中色氨酸的测定

　　GB/T 20195 动物饲料试样的制备

　　JJG 1064 氨基酸分析仪

　　3 常规酸水解法

　　3 . 1 原理

　　饲料中蛋白质在 110 ℃ 、6 mol/L盐酸溶液作用下水解成氨基酸，经离子交换色谱分离和苗三酮柱后衍生化，脯氨酸于 440 nm 波长处测定，其他氨基酸于 570 nm 波长处测定。

　　3 . 2 试剂或材料

　　除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯。

　　3 . 2 . 1 水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。

　　GB/T 18246—2019

　　3 . 2 . 2 盐酸：优级纯。

　　3.2.3 盐酸水解溶液(6 mol/L)：将 500 mL盐酸(3.2.2) 与 500 mL水混合，加 1g苯酚，混匀。

　　3.2.4 柠檬酸钠缓冲溶液[pH=2.2,c(Na+ ) = 0.2 mol/L]：称取柠檬酸三钠 19.6 g 于 1 000 mL 容量瓶中，加水溶解后加入盐酸(3 . 2 . 2) 16 . 5 mL,硫二甘醇 5 . 0 mL,苯酚 1 g,用水定容并过滤。

　　3 . 2 . 5 氨基酸标准储备溶液：含 17 种常规蛋白水解液分析用氨基酸(天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸)，各组分浓度均为 2 . 50 μmol/mL,应使用有证标准溶液。

　　3 . 2 . 6 氨基酸标准工作溶液：准确移取 2 mL 的氨基酸标准储备溶液(3 . 2 . 5) 置于 50 mL 容量瓶中，以柠檬酸钠缓冲溶液(3 . 2 . 4)定容，各氨基酸组分浓度为 100 nmol/mL,用安瓿分装密封，每支约 1 mL,在2 ℃ ~8 ℃下保存，有效期 3 个月。

　　3 . 2 . 7 不同 pH 值和离子强度的柠檬酸钠缓冲溶液与苗三酮溶液：按照仪器说明书配制或购买。

　　3 . 2 . 8 液氮 。

　　3 . 3 仪器设备

　　3 . 3 . 1 氨基酸自动分析仪：具备阳离子交换柱、苗三酮柱后衍生装置及 570 nm 和 440 nm 光度检测器。

　　3.3.2 天平：感量 0.1 mg 和 0.01 mg。

　　3 . 3 . 3 真空泵 。

　　3 . 3 . 4 喷灯 。

　　3.3.5 恒温干燥箱：温度可达 110 ℃ ±2 ℃。

　　3.3.6 离心机：转速不低于 4 000 r/min。

　　3 . 3 . 7 旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至 65 ℃间调温，控温精度± 1 ℃ ,真空度可低至 3 . 3 × 10 3 Pa (25 mmHg)。

　　3 . 4 样品

　　按 GB/T 20195 进行样品制备，粉碎过 0 . 25 mm孔径筛，混合均匀，装入密闭容器中保存，备用。

　　对于粗脂肪含量大于或等于 5%的样品，需将脱脂后的样品风干、混匀，装入密闭容器中备用。 对于粗脂肪小于 5%的样品，可直接称样。

　　3 . 5 试验步骤

　　3 . 5 . 1 样品前处理

　　平行做两份试验。称取试样 50 mg~ 100 mg(含蛋白质约 7. 5 mg~ 25 mg, 精确至 0. 1 mg) 于20 mL安瓿或水解管中，准确加入 10 mL盐酸水解溶液(3 . 2 . 3),置液氮(3 . 2 . 8) 中冷冻，使用真空泵抽真空至 7 Pa( ≤5 × 10 - 2 mmHg)后用喷灯封口或充氮气 1 min后旋紧管盖。 将安瓿或水解管放在 110 ℃ ±2 ℃恒温干燥箱中，水解 22 h~24 h。 冷却，混匀，开管，过滤，用移液管精确吸取适量的滤液，置于旋转蒸发器或浓缩器中，60 ℃下抽真空蒸发至干，必要时，加少许水，重复蒸干 1 次 ~2 次 。 加入3 mL~ 5 mL柠檬酸钠缓冲溶液(3 . 2 . 4)复溶，使试样溶液中氨基酸浓度达到 50 nmol/mL~250 nmol/mL,摇匀，过

　　滤或离心，上清液待上机测定。

　　GB/T 18246—2019

　　3 . 5 . 2 测定

　　将氨基酸标准工作溶液(3 . 2 . 6)注入氨基酸自动分析仪，以不同 pH 和离子强度的柠檬酸钠缓冲溶液与苗三酮溶液(3 . 2 . 7)作为流动相和衍生剂，适当调整仪器操作程序及参数和洗脱用缓冲溶液试剂配比，应符合 JJG 1064 氨基酸分析仪检定规程的要求，并保证苏氨酸-丝氨酸、甘氨酸-丙氨酸以及亮氨酸-异亮氨酸分离度分别不得小于 85%、90%和 80%,其标准溶液色谱图参见附录 B 的图 B. 1、图 B. 2 。 注入制备好的试样溶液和相应的氨基酸标准工作溶液进行测定，每 5 个样品(即 10 个单样)为一组，组间插入氨基酸标准工作溶液(3 . 2 . 6)进行校准。 以保留时间定性，单点外标法定量。 试样中氨基酸的峰面积应在标准工作溶液相应峰面积的 30%~200%,否则应用柠檬酸钠缓冲溶液(3 . 2 . 4)稀释后重测。

　　3 . 6 试验数据处理

　　试样中氨基酸含量以其质量分数 ∞(%)计，未脱脂试样按式(1)计算，脱脂试样按式(2)计算：

　　……………………( 1 )

　　……………………

　　式中：

　　n —试样水解溶液稀释倍数;

　　Ai — 试样溶液中对应氨基酸的峰面积;

　　v —试样水解溶液体积，单位为毫升(mL) ;

　　c —标准工作溶液中对应氨基酸的浓度，单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL) ;

　　M —氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol),各氨基酸摩尔质量见表 A. 1 ;

　　vst —氨基酸标准溶液进样体积，单位为微升(μL) ;

　　Ast — 氨基酸标准溶液中对应氨基酸的峰面积;

　　m —试样质量，单位为毫克(mg) ;

　　vi —试样溶液进样体积，单位为微升(μL) ;

　　F —粗脂肪含量，% 。

　　以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数。

　　3 . 7 精密度

　　在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值，当含量不大于0 . 5%时，不超过这两个测定值算术平均值的 5%;含量大于 0 . 5%时，不超过 4%。

　　4 氧化酸水解法

　　4 . 1 含硫氨基酸的测定

　　按 GB/T 15399 的规定执行。

　　4 . 2 其他氨基酸的测定

　　4 . 2 . 1 原理

　　以偏重亚硫酸钠为氧化终止剂时，可测定除酪氨酸、色氨酸以外的其他蛋白水解氨基酸;以氢溴酸

　　GB/T 18246—2019

　　为终止剂时，可测定除酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和色氨酸以外的、包括含硫氨基酸在内的其他氨基酸的含量。

　　4 . 2 . 2 样品前处理

　　样品前处理按 GB/T 15399 的规定执行。

　　4 . 2 . 3 测定

　　将含有磺基丙氨酸、蛋氨酸砜与氨基酸标准溶液注入氨基酸自动分析仪，以不同 pH 和离子强度的柠檬酸钠缓冲溶液与苗三酮溶液(3 . 2 . 7) 作为流动相和衍生剂，调整仪器操作程序及参数、洗脱用缓冲溶液试剂配比，应符合 JJG 1064 氨基酸分析仪检定规程的要求并保证苏氨酸-丝氨酸、甘氨酸-丙氨酸、亮氨酸-异亮氨酸和蛋氨酸砜-天门冬氨酸的分离度分别不得小于 85%、90%、80%和 85%,其标准溶液色谱图见附录 B 的图 B. 3 。测定中每 5 个样品(即 10 个单样)为一组，组间插入磺基丙氨酸、蛋氨酸砜与氨基酸标准溶液进行校准。 以保留时间定性，单点外标法定量。 试样中氨基酸的峰面积应在标准工作溶液相应峰面积的 30%~200%,否则应用柠檬酸钠缓冲溶液(3 . 2 . 4)稀释后重测。

　　4 . 2 . 4 试验数据处理

　　试样中胱氨酸(含半胱氨酸)和蛋氨酸含量的计算同 GB/T 15399 。

　　其他氨基酸的计算，同式(1)、式(2) 。

　　4 . 2 . 5 精密度

　　同 3 . 7 。

　　5 碱水解法

　　按 GB/T 15400 的规定执行。

　　6 酸提取法

　　6 . 1 原理

　　饲料中游离氨基酸以稀盐酸提取，经离子交换色谱分离、苗三酮柱后衍生测定。

　　6 . 2 试剂或材料

　　除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯。

　　6 . 2 . 1 水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。

　　6 . 2 . 2 氢氧化钠：优级纯。

　　6.2.3 盐酸提取溶液(0.1 mol/L)：取 8.3 mL盐酸(3.2.2) 于 1 000 mL容量瓶中，加 20 mL硫二甘醇，用水定容，摇匀。

　　6 . 2 . 4 5-磺基水杨酸溶液：称取 6 g 5-磺基水杨酸，加水溶解并定容至 100 mL。

　　6 . 2 . 5 氢氧化钠溶液(1 mol/ L) ：称取 4 g氢氧化钠，溶解于 100 mL水中。

　　6.2.6 柠檬酸钠缓冲溶液[pH=2.2,c(Na+ ) =0.2 mol/L]：同 3.2.4。

　　6 . 2 . 7 氨基酸标准储备溶液：同 3 . 2 . 5 。

　　GB/T 18246—2019

　　6 . 2 . 8 氨基酸标准工作溶液：同 3 . 2 . 6 。

　　6 . 2 . 9 不同 pH 和离子强度的柠檬酸钠缓冲溶液与苗三酮溶液：同 3 . 2 . 7 。

　　6 . 3 仪器设备

　　6 . 3 . 1 氨基酸自动分析仪：同 3 . 3 . 1 。

　　6 . 3 . 2 天平：同 3 . 3 . 2 。

　　6 . 3 . 3 离心机：同 3 . 3 . 6 。

　　6 . 3 . 4 超声波振荡器。

　　6 . 4 样品

　　按 GB/T 20195 进行样品制备，粉碎过 0 . 25 mm孔径筛，混合均匀，装入密闭容器中保存，备用。

　　6 . 5 试验步骤

　　6 . 5 . 1 样品前处理

　　6 . 5 . 1 . 1 添加剂预混合饲料

　　平行做两份试验。 称取 1 g~2 g试样(精确到 0 . 2 mg), 加入盐酸提取溶液(6 . 2 . 3) 30 mL, 用超声波振荡器超声提取 15 min,静置片刻，将上清液过滤至 100 mL容量瓶中，再用 15 mL~20 mL水重复提取两次，将上清液过滤到上述容量瓶中，用水冲洗提取瓶和滤纸上的残渣，并定容。 若试样提取过程中过滤太慢，也可离心 10 min( 4 000 r/min)合并上清液并加水定容。 摇匀，滤液供上机测定。

　　6 . 5 . 1 . 2 配合饲料、浓缩饲料和精料补充料

　　平行做两份试验。 称取试样 2 g~ 5 g(精确到 0 . 5 mg) 100 mL 离心管中，加入盐酸提取溶液 (6.2.3) 50 mL,用超声波振荡器超声提取 30 min, 4 000 r/min离心 10 min,上清液移至 100 mL容量瓶中，残渣用 45 mL盐酸提取溶液(6 . 2 . 3)重复提取一次，离心后合并上清液，加水定容;准确移取 10 mL滤液于 50 mL烧杯中，加 5 mL 5-磺基水杨酸溶液(6 . 2 . 4),搅拌 5 min,过滤或离心，除去沉淀，用氢氧化钠溶液(6 . 2 . 5)调节滤液或上清液 pH 至 2 . 2,用柠檬酸钠缓冲溶液(6 . 2 . 6)定容至 100 mL,供上机测定。

　　6 . 5 . 2 测定

　　同 3 . 5 . 2 。

　　6 . 6 试验数据处理

　　试样中氨基酸含量以其质量分数 ∞(%)计，按式(3)计算：

　　……………………( 3 )

　　式中：

　　n —试样提取溶液稀释倍数;

　　Ai — 试样溶液中对应氨基酸的峰面积;

　　V —试样提取溶液体积，单位为毫升(mL) ;

　　c —标准工作溶液中对应氨基酸的浓度，单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL) ;

　　M —氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol),各氨基酸摩尔质量见附录中表 A. 1 ;

　　GB/T 18246—2019

　　vst —氨基酸标准溶液进样体积，单位为微升(μL) ;

　　Ast — 氨基酸标准溶液中对应氨基酸的峰面积;

　　m —试样质量，单位为克(g) ;

　　vi —试样溶液进样体积，单位为微升(μL) ;

　　以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数。

　　6 . 7 精密度

　　同 3 . 7 。

　　GB/T 18246—2019

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　各氨基酸的摩尔质量和定量限

　　各氨基酸的摩尔质量和定量限见表 A. 1 。

　　表 A.1 各种氨基酸的摩尔质量和定量限

　　GB/T 18246—2019

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　氨基酸标准溶液色谱图

　　氨基酸标准溶液色谱图(570 nm)、氨基酸标准溶液色谱图(440 nm)和磺基丙氨酸、蛋氨酸砜与氨基酸标准溶液色谱图分别见图 B. 1、图 B. 2 和图 B. 3 。

　　说明：

　　1 —天门冬氨酸(Asp) ;

　　2 —苏氨酸(Thr) ;

　　3 —丝氨酸(Ser) ;

　　4 —谷氨酸(Glu) ;

　　5 —甘氨酸(Gly) ;

　　6 —丙氨酸(Ala) ;

　　7 —胱氨酸(Cys) ;

　　8 —缬氨酸(Val) ;

　　9 —蛋氨酸(Met) ;

　　10 —异亮氨酸(Ile) ;

　　11 —亮氨酸(Leu) ;

　　12 — 酪氨酸(Tyr) ;

　　13 —苯丙氨酸(Phe) ;

　　14—赖氨酸(Lys) ;

　　15 —组氨酸(His) ;

　　16 —精氨酸(Arg) 。

　　图 B.1 氨基酸标准溶液( 100 nmol/mL，570 nm)色谱图

　　GB/T 18246—2019

　　说明：

　　1 —天门冬氨酸(Asp) ;

　　2 — 苏氨酸(Thr) ;

　　3 — 丝氨酸(Ser) ;

　　4 — 谷氨酸(Glu) ;

　　5 — 脯氨酸(Pro) 。

　　图 B.2 氨基酸标准溶液( 100 nmol/mL，440 nm)色谱图

　　GB/T 18246—2019

　　说明：

　　1 —磺基丙氨酸(CySO 3 H) ;

　　2 —蛋氨酸砜(MetSON) ;

　　3 —天门冬氨酸(Asp) ;

　　4 — 苏氨酸(Thr) ;

　　5 — 丝氨酸(Ser) ;

　　6 — 谷氨酸(Glu) ;

　　7 — 脯氨酸(Pro) ;

　　8 —甘氨酸(Gly) ;

　　9 — 丙氨酸(Ala) ;

　　10 —胱氨酸(Cys) ;

　　11 — 缬氨酸(Val) ;

　　12 — 蛋氨酸(Met) ;

　　13 — 异亮氨酸(Ile) ;

　　14— 亮氨酸(Leu) ;

　　15 — 酪氨酸(Tyr) ;

　　16 — 苯丙氨酸(Phe) ;

　　17 —赖氨酸(Lys) ;

　　18 — 组氨酸(His) ;

　　19 —精氨酸(Arg) 。

　　图 B.3 磺基丙氨酸、蛋氨酸砜与氨基酸标准溶液色谱图