GB/T 18641-2018 伪狂犬病诊断方法

　　ICS 1 1 . 220 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 18641—2018

　　代替 GB/T 18641—2002

　　伪狂犬病诊断方法

　　Diagnosticmethodforpseudorabies

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 18641—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准代替 GB/T 18641—2002《伪狂犬病诊断技术》。 与 GB/T 18641—2002 相比，主要技术变化如下：

　　— 增加了检测猪伪狂犬病病毒 gB抗体的阻断 ELISA方法;

　　— 增加了检测伪狂犬病病毒野毒 gE-PCR方法。

　　本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

　　本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口 。

　　本标准起草单位：华中农业大学、中国动物卫生与流行病学中心。

　　本标准主要起草人：何启盖、库旭钢、吴斌、陈品、方六荣、李晓成、姜雯、孟宪荣、范盛先、刘正飞、吴发兴、吴美洲、陈焕春。

　　本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

　　—GB/T 18641—2002 。

　　GB/T 18641—2018

　　引 言

　　伪狂犬病 (Pseudorabies, Pr; Aujeszky’s disease, AD) 是由伪狂犬病病毒 (Pseudorabies virus,

　　PrV)引起的一种多种动物共患传染病，可危害猪、牛 、羊 、犬 、猫 、家兔、小鼠、狐狸和浣熊等多种动物，呈世界性分布。 该病对养猪业的危害最为严重，病毒感染后，妊娠母猪出现流产、产死胎和木乃伊胎; 15 日龄内仔猪出现神经症状，致死率 100% ;断 奶 仔 猪 出 现 神 经 症 状 和 呼 吸 道 症 状，致 死 率 10% ~ 20%;生长猪和育肥猪出现呼吸道症状，增重缓慢、饲料报酬低;种母猪发生返情和空怀，屡配不孕;公猪出现睾丸炎性肿胀或萎缩，失去种用能力。 除猪外，其他动物感染伪狂犬病病毒后，可出现体温升高、奇痒和脑脊髓炎等临床症状，最终死亡，但呈散发形式。

　　本标准规定的常规血清学技术可用于非免疫动物的诊断、血清流行病学调查和免疫动物抗体检测。其中，中和试验特异性强，是国际贸易中通用的法定方法，用于口岸进出口检疫;乳胶凝集试验简便快速、敏感性高，适用于基层单位对该病的现场检测和筛查;酶联免疫吸附试验(ELISA) 包括全病毒抗原ELISA(PrV-ELISA)和 gB-ELISA方法，适用于实验室开展大批血清样品抗体检测。 本标准中的 gE- ELISA鉴别诊断方法，可区分伪狂犬病病毒 gE基因缺失疫苗免疫猪和 自然感染猪，因此，可用于猪群野毒感染的诊断和流行病学调查。 本标准中规定的 3 种 ELISA 方法仅用于检测猪血清中的伪狂犬病病毒抗体，不适用于检测其他动物血清中伪狂犬病病毒抗体。

　　本标准规定的病原学诊断方法用于检测死亡和剖检动物的病料、流产胎儿组织(如扁桃体、肺脏和脑组织等)、活体动物的扁桃体、鼻拭子和公猪精液中的伪狂犬病病毒。 其中，病毒分离鉴定限于有条件的实验室使用，聚合酶链式反应具有快速和灵敏的特点，可同时检测大批样品，但需注意样品交叉污染。家兔接种试验需在有隔离和消毒条件的动物房中进行。

　　GB/T 18641—2018

　　伪狂犬病诊断方法

　　1 范围

　　本标准规定了伪狂犬病的血清中和试验、乳胶凝集试验、伪狂犬病病毒抗体 ELISA( PrV-ELISA) 、猪伪狂犬病 gB-ELISA(阻断法)和 gE-ELISA(阻断法)等抗体检测方法及病毒分离鉴定、聚合酶链式反应和家兔接种试验等病原检测方法。

　　本标准适用于猪、牛、羊、犬、猫及其他易感动物的伪狂犬病诊断、检疫、免疫抗体评估和流行病学调查等。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　NY/T 678 猪伪狂犬病免疫酶试验方法

　　3 血清中和试验(采用固定病毒稀释血清法)

　　3 . 1 仪器

　　3 . 1 . 1 二氧化碳培养箱。

　　3 . 1 . 2 生物安全柜。

　　3 . 1 . 3 微量移液器。

　　3 . 2 耗材

　　3 . 2 . 1 细胞培养瓶。

　　3 . 2 . 2 96 孔细胞培养板。

　　3 . 2 . 3 吸管 。

　　3 . 2 . 4 移液器吸头。

　　3 . 3 试剂

　　3 . 3 . 1 DMEM培养液(见附录 A) 。

　　3.3.2 0.25%胰酶(见附录 A)。

　　3 . 3 . 3 PK-15 细胞 。

　　3 . 3 . 4 伪狂犬病阳性血清。

　　3 . 3 . 5 阴性血清。

　　3 . 3 . 6 伪狂犬病病毒(野毒株)。

　　GB/T 18641—2018

　　3 . 4 操作步骤

　　3 . 4 . 1 病毒半数细胞培养物感染量(TCID50) 的测定

　　3 . 4 . 1 . 1 病毒培养和收获

　　将伪狂犬病病毒(野毒株)接种于长成单层的 PK-15 细胞，接种量为液体培养基的 1/10 体积，37 ℃培养，待出现病变后，将细胞培养物冻融，离心去除细胞碎片，收获病毒。

　　3 . 4 . 1 . 2 病毒效价测定

　　3 . 4 . 1 . 2 . 1 用 DMEM培养液将伪狂犬病病毒作连续 10 倍稀释，即 10-1 、10-2 ~10-9 稀释，每个病毒稀释度取 100 μL加入 96 孔细胞培养板中。 每个病毒稀释度接 8 个孔。

　　3.4. 1 .2.2 每孔加入 100 μL 经 0. 25% 胰酶消化的 PK-15 细胞悬液(细胞含量以 105 个/mL 左右为宜)。设非接毒、加等量 DMEM 的正常细胞培养对照。

　　3.4. 1 .2.3 细胞 96 孔板置 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养。

　　3 . 4 . 1 . 2 . 4 逐日观察接毒细胞的病变，观察 4 d~5 d,记录每个病毒稀释度接种细胞的细胞病变(CPE)孔数。 在观察期内，未接种病毒的细胞应无 CPE。

　　3.4. 1 .3 TCID50 计算

　　按照 Reed-Muench法计算病毒的 TCID50(见附录 B)。

　　3 . 4 . 2 血清中和抗体效价的测定

　　3 . 4 . 2 . 1 血清灭活

　　将无溶血、清亮的待检血清置于 56 ℃水浴，灭活 30 min。

　　3 . 4 . 2 . 2 血清稀释

　　在细胞培养板孔中加入 50 μL DMEM培养液，随后在第 1 孔中加入待检血清 50 μL 混匀后，用微量移液器取出 50 μL加至第 2 孔中，混匀后再取出 50 μL加至第 3 孔中，依此类推，直至第 10 孔(将混合液弃去 50 μL),血清稀释度即为 1 ∶ 2、1 ∶ 4、1 ∶ 8~1 ∶ 1 024,每份待检血清稀释度作 4 个重复。

　　3 . 4 . 2 . 3 加入病毒

　　将 50 μL含 200 个 TCID50 的病毒液加到不同稀释度的血清孔中，37 ℃作用 1 h。

　　3 . 4 . 2 . 4 接种细胞

　　每孔中加入 100 μL PK-15 细胞悬液(细胞含量以 3 × 10 5 个/mL~ 5 × 10 5 个/mL 左右为宜)，置37 ℃ 、5% CO2 培养箱中培养。

　　3 . 4 . 2 . 5 设立对照组

　　3 . 4 . 2 . 5 . 1 病毒对照组

　　每次试验均应设病毒对照。 将 200 TCID50 病毒液作 10 倍、100 倍、1 000 倍稀释。 每孔加入 50 μL不同稀释度的病毒液、50 μL DMEM培养液和 100 μL PK-15 细胞悬液。 每个稀释度病毒 4 个重复。

　　3 . 4 . 2 . 5 . 2 血清对照组

　　用已知中和效价的阳性血清、阴性血清与相同滴度的病毒孵化后，接种 PK-15 细胞;同时设正常培养的细胞对照。

　　GB/T 18641—2018

　　3 . 4 . 2 . 6 结果观察

　　逐日观察，记录病变和非病变的孔数，共观察 4 d~5 d。 1 000 倍稀释病毒(0 . 2 TCID50) 对照组不引起细胞病变，100 倍稀释病毒(2 TCID50)对照组应有 0~2 孔细胞病变，10 倍稀释病毒(20 TCID50) 对照组均应有细胞病变;阳性血清、阴性血清和正常细胞对照成立，待检血清对 PK-15 细胞应无毒性，测定结果方有效，否则该试验不成立。

　　3 . 4 . 2 . 7 结果判定

　　按照 Reed-Muench方法(见附录 B)计算抗体效价，如血清中和效价 ≥1 ∶ 2,可判定为伪狂犬病抗体阳性。

　　4 乳胶凝集试验

　　4 . 1 仪器

　　10 μL~50 μL微量移液器。

　　4 . 2 耗材

　　4 . 2 . 1 移液器吸头。

　　4 . 2 . 2 洁净干燥载玻片。

　　4 . 2 . 3 洁净牙签。

　　4 . 3 试剂

　　4 . 3 . 1 伪狂犬病病毒乳胶凝集抗原(使用前轻轻摇匀)。

　　4 . 3 . 2 伪狂犬病阳性和阴性血清，稀释液(见附录 C) 。

　　4 . 4 操作步骤

　　4 . 4 . 1 对照试验

　　取等量的乳胶凝集试验抗原(约 20 μL)分别与阴性血清、阳性血清在洁净的玻片上混合，混合液直径以不超过 1 . 0 cm 为宜。 如阴性血清与抗原混合后不出现凝集，而阳性血清与抗原混合后出现相当于或高于 50%凝集程度，则对照试验成立。

　　4 . 4 . 2 待检血清处理

　　待检血清不必经热灭活或其他方式灭活，但应清亮透明，无溶血。

　　4 . 4 . 3 待检血清的检测

　　将待检血清用稀释液倍比稀释后，各稀释度取 15 μL~20 μL与等量胶乳凝集抗原在洁净干燥的载玻片上用牙签搅拌充分混合，混合液直径以不超过 1 . 0 cm 为宜。 静置，在 1 min~3 min 内观察混合液的凝集现象。

　　4 . 4 . 4 判定标准

　　100%凝集程度：混合液透亮，凝集颗粒聚集在液滴的边缘。

　　75%凝集程度：混合液透明，出现大的凝集颗粒。

　　GB/T 18641—2018

　　50%凝集程度：混合液略浑浊，凝集颗粒较细。

　　25%凝集程度：混合液浑浊，有少量凝集颗粒。

　　不凝集：待检血清与抗原混合后，呈浑浊状态，无可见凝集颗粒。

　　4 . 4 . 5 结果判定

　　4 . 4 . 5 . 1 待检血清倍比稀释后，分别与抗原混合，如出现 50%凝集程度，该血清判为伪狂犬病抗体阳性，否则判为抗体阴性。 以出现 50%凝集程度的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价。

　　4 . 4 . 5 . 2 本方法检测感染或免疫后产生的早期抗体 IgM。 当 IgM 消失后，本方法检测为阴性。 此时，可用 3 . 4 . 2“血清中和试验(适用于所有动物待检血清检测)”或 5 . 2 或 5 . 3 或 5 . 4 的“酶联免疫吸附试验检测(仅适用于猪血清)”,可能出现以下 3 种结果：

　　a) 任何一种方法为阴性，判为伪狂犬病抗体阴性;

　　b ) 任何一种方法为可疑，建议在间隔 2 周后再用血清中和试验或 ELISA 检测，如这两种方法均为阴性或可疑，判为阴性;

　　c) 血清中和试验和酶联免疫吸附试验均为阳性或某一种方法为阳性，判为伪狂犬病病毒抗体阳性。

　　5 酶联免疫吸附试验

　　5 . 1 抗体检测项目分类

　　本试验包含检测猪伪狂犬病病毒抗体 ELISA(PrV-ELISA)、猪伪狂犬病病毒 gB抗体 ELISA(gB- ELISA)和猪伪狂犬病病毒 gE抗体 ELISA(gE-ELISA)方法。 这三种 ELISA 方法均只能用于猪血清中伪狂犬病病毒不同抗体的检测，因为其他动物检测没有正式的阴、阳性判定标准。

　　5 . 2 prv-ELISA

　　5 . 2 . 1 仪器设备

　　5 . 2 . 1 . 1 酶标仪 。

　　5 . 2 . 1 . 2 恒温培养箱 。

　　5 . 2 . 1 . 3 微量移液器 。

　　5 . 2 . 2 耗材

　　5 . 2 . 2 . 1 酶标板 。

　　5 . 2 . 2 . 2 移液器吸头。

　　5 . 2 . 2 . 3 实验用水(本标准所用水应符合 GB/T 6682 中二级水的规格)。

　　5 . 2 . 3 试剂

　　5 . 2 . 3 . 1 抗原(纯化后灭活的伪狂犬病病毒)。

　　5 . 2 . 3 . 2 酶标抗体(HRP标记兔抗猪 IgG抗体)。

　　5 . 2 . 3 . 3 阴性血清 。

　　5 . 2 . 3 . 4 阳性血清 。

　　5 . 2 . 3 . 5 待检血清 。

　　5 . 2 . 3 . 6 洗涤液(配制方法见附录 C) 。

　　5 . 2 . 3 . 7 抗原包被液(配制方法见附录 C) 。

　　GB/T 18641—2018

　　5 . 2 . 3 . 8 封闭液(配制方法见附录 C) 。

　　5 . 2 . 3 . 9 四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(配制方法见附录 C) 。

　　5 . 2 . 3 . 10 终止液(配制方法见附录 C) 。

　　5 . 2 . 3 . 1 1 样品稀释液(配制方法见附录 C) 。

　　5 . 2 . 4 操作步骤

　　5 . 2 . 4 . 1 包被

　　用包被液将抗原稀释到工作浓度后加入酶标板孔内，每孔 100 μL, 37 ℃作用 1 h 后置 4 ℃冰箱过夜。

　　5 . 2 . 4 . 2 洗涤

　　弃去孔内液体，用洗涤液洗 3 次，每次 3 min,用吸水纸拍干。

　　5 . 2 . 4 . 3 封闭

　　各孔中加入封闭液 100 μL, 37 ℃作用 1 h。 按 5 . 2 . 4 . 2 步骤洗涤。

　　如等效采用商品化试剂盒，可省去 5 . 2 . 4 . 1~5 . 2 . 4 . 3 步骤。

　　5 . 2 . 4 . 4 加入待检血清和阴性、阳性血清对照

　　待检血清用稀释液进行 1 ∶ 40 倍稀释，加入抗原孔中，每孔 100 μL;同时将阴性血清对照和阳性血清对照各加入 3 个抗原孔中，分别标记为 A1 、A2 、A3 和 A4 、A5 、A6 孔 。 37 ℃作用 1 h, 重复 5 . 2 . 4 . 2步骤。

　　5 . 2 . 4 . 5 加入酶标抗体

　　用样品稀释液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔加入 100 μL, 37 ℃作用 1 h,重复 5 . 2 . 4 . 2 步骤。

　　5 . 2 . 4 . 6 加入底物

　　每孔加入 100 μL TMB溶液，室温避光显色 25 min。

　　5 . 2 . 4 . 7 终止反应

　　每孔加入 50 μL终止液终止反应。

　　5.2.4.8 读取吸光度值(OD490)

　　在酶标仪上于 490 nm 波长条件下，测定吸光度值。

　　5 . 2 . 4 . 9 结果判定

　　5 . 2 . 4 . 9 . 1 按式(1)计算血清检测值与阳性对照血清检测值之比(s/p)值 ：

　　s/p …………………………( 1 )

　　式中：

　　SCX — 样品 A490 ;

　　NCX — (A1 OD490+A2 OD490+A3 OD490)/3 ;

　　GB/T 18641—2018

　　PCX — (A4 OD490+A5 OD490+A6 OD490)/3 。

　　5.2.4.9.2 如果 s/p≥0.5,则判为抗体阳性。

　　5.2.4.9.3 如果 s/p<0.5,则判为抗体阴性。

　　5 . 3 猪伪狂犬病病毒 gB-ELISA(阻断法)

　　5 . 3 . 1 仪器

　　5 . 3 . 1 . 1 酶标仪 。

　　5 . 3 . 1 . 2 恒温培养箱 。

　　5 . 3 . 1 . 3 微量移液器 。

　　5 . 3 . 2 耗材

　　5 . 3 . 2 . 1 酶标板 。

　　5 . 3 . 2 . 2 移液器吸头。

　　5 . 3 . 2 . 3 实验用水(本标准所用水应符合 GB/T 6682 中二级水的规格)。

　　5 . 3 . 3 试剂

　　5 . 3 . 3 . 1 猪伪狂犬病病毒 gB重组蛋白为抗原的 ELISA包被板。

　　5 . 3 . 3 . 2 辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗猪伪狂犬病病毒 gB单克隆抗体。

　　5 . 3 . 3 . 3 阴性血清 。

　　5 . 3 . 3 . 4 阳性血清 。

　　5 . 3 . 3 . 5 待检血清 。

　　5 . 3 . 3 . 6 四甲基联苯胺(TMB)底物溶液。

　　5 . 3 . 3 . 7 洗涤液 。

　　5 . 3 . 3 . 8 终止液(配制方法见附录 C) 。

　　5 . 3 . 4 操作步骤

　　5 . 3 . 4 . 1 稀释待检血清

　　用样品稀释液将待检血清、阴性对照、阳性对照作 1 ∶ 1 倍稀释(即 100 μL血清加 100 μL稀释液)，其中阴性对照、阳性对照各做 2 个重复，分别标记为 A1 、A2 和 B1 、B2 。

　　5 . 3 . 4 . 2 血清孵育

　　将稀释血清 100 μL加入抗原孔中，18 ℃ ~26 ℃作用 1 h。

　　5 . 3 . 4 . 3 洗涤

　　甩掉板孔中的溶液，每孔加 300 μL洗涤液，洗涤 3 次 。

　　5 . 3 . 4 . 4 加入酶标抗体

　　加入辣根过氧化物酶标记的抗猪伪狂犬病病毒 gB单克隆抗体，室温(18 ℃ ~26 ℃)作用 20 min,洗涤 3 次 。

　　5 . 3 . 4 . 5 加入底物

　　每孔加入 100 μL TMB底物溶液，室温避光显色 15 min。

　　GB/T 18641—2018

　　5 . 3 . 4 . 6 终止反应

　　每孔加入 50 μL终止液，终止反应。

　　5.3.4.7 读取吸光度值(OD650)

　　在酶标仪上于 650 nm 波长条件下测定吸光度值。

　　5 . 3 . 4 . 8 结果计算和判定

　　5 . 3 . 4 . 8 . 1 对照组中，阴性血清平均 OD值减去阳性血清平均 OD值之差大于 0 . 30 时，试验有效。

　　5 . 3 . 4 . 8 . 2 按式(2)计算待检血清样品 OD650 与阴性对照血清 OD650 之比(s/N)值 ：

　　s/N …………………………( 2 )

　　式中：

　　SCX — 样品 OD650 ;

　　NCX — (A1 OD650+A2 OD650)/2 。

　　5 . 3 . 4 . 8 . 3 当 s/N>0 . 70 时，判为猪伪狂犬病病毒(gB)抗体阴性。

　　5 . 3 . 4 . 8 . 4 当 s/N<0 . 60 时，判为猪伪狂犬病病毒(gB)抗体阳性。

　　5.3.4.8.5 当 s/N 值为 0.60~0.70 时，判为猪伪狂犬病病毒(gB)抗体可疑。可于 9 d~ 14 d 后再采血，重复检测，如仍为可疑，可判为阴性。

　　5 . 4 猪伪狂犬病病毒 gE-ELISA(阻断法)

　　按照 NY/T 678 中“gE-ELISA”的操作方法进行。

　　5 . 4 . 1 仪器

　　5 . 4 . 1 . 1 酶标仪 。

　　5 . 4 . 1 . 2 恒温培养箱 。

　　5 . 4 . 1 . 3 微量移液器 。

　　5 . 4 . 2 耗材

　　5 . 4 . 2 . 1 酶标板 。

　　5 . 4 . 2 . 2 移液器吸头。

　　5 . 4 . 2 . 3 实验用水(本标准所用水应符合 GB/T 6682 中二级水的规格)。

　　5 . 4 . 3 试剂

　　5 . 4 . 3 . 1 猪伪狂犬病病毒 gE重组蛋白为抗原的 ELISA包被板。

　　5 . 4 . 3 . 2 辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗猪伪狂犬病病毒 gE单克隆抗体。

　　5 . 4 . 3 . 3 阴性血清 。

　　5 . 4 . 3 . 4 阳性血清 。

　　5 . 4 . 3 . 5 待检血清 。

　　5 . 4 . 3 . 6 四甲基联苯胺(TMB)底物溶液。

　　5 . 4 . 3 . 7 洗涤液 。

　　5 . 4 . 3 . 8 终止液(配制方法见附录 C) 。

　　GB/T 18641—2018

　　5 . 4 . 4 操作步骤

　　5 . 4 . 4 . 1 稀释待检血清

　　用样品稀释液将待检血清、阴性血清、阳性血清作 1 ∶ 1 倍稀释(即 100 μL血清加 100 μL稀释液)，其中阴性血清、阳性血清等分别做 2 个重复，分别标记为 A1 、A2 和 B1 、B2 。

　　5 . 4 . 4 . 2 血清孵育

　　将稀释血清 100 μL加入抗原孔中，18 ℃ ~26 ℃作用 1 h。

　　5 . 4 . 4 . 3 洗涤

　　甩掉板孔中的溶液，每孔加 300 μL洗涤液，洗涤 3 次 。

　　5 . 4 . 4 . 4 加入酶标抗体

　　加入辣根过氧化物酶标记的抗猪伪狂犬病病毒 gE单克隆抗体，室温(18 ℃ ~26 ℃)作用 20 min,洗涤 3 次 。

　　5 . 4 . 4 . 5 加入底物

　　每孔加入 100 μL TMB底物溶液，室温避光显色 15 min。

　　5 . 4 . 4 . 6 终止反应

　　每孔加入 50 μL终止液终止反应。

　　5.4.4.7 读取吸光度值(OD650)

　　在酶标仪上于 650 nm 波长条件下测定吸光度值。

　　5 . 4 . 4 . 8 结果计算和判定

　　5 . 4 . 4 . 8 . 1 对照组中，阴性血清平均 OD值减去阳性血清平均 OD值之差大于 0 . 30 时，试验有效。

　　5 . 4 . 4 . 8 . 2 按式(3)计算待检血清样品 OD650 与阴性对照血清 OD650 之比(s/N)值 ：

　　s/N …………………………( 3 )

　　式中：

　　SCX — 样品 A650 ;

　　NCX — (A1 OD650+A2 OD650)/2 。

　　5 . 4 . 4 . 8 . 3 当 s/N>0 . 70 时，判为猪伪狂犬病病毒(gE)抗体阴性。

　　5 . 4 . 4 . 8 . 4 当 s/N<0 . 60 时，判为猪伪狂犬病病毒(gE)抗体阳性。

　　5.4.4.8.5 当 s/N 值为 0.60~0.70 时，判为猪伪狂犬病病毒(gE)抗体可疑。可于 9 d~14 d 后再采血，重复检测，如仍为可疑，判为阳性。

　　6 病毒分离鉴定

　　6 . 1 仪器

　　6 . 1 . 1 高速冷冻离心机。

　　GB/T 18641—2018

　　6 . 1 . 2 组织匀浆器(或研钵)。

　　6 . 1 . 3 生物安全柜。

　　6 . 1 . 4 微量移液器。

　　6 . 2 耗材

　　6.2. 1 直径为 0.45 μm 滤膜的滤器。

　　6 . 2 . 2 细胞培养瓶。

　　6 . 2 . 3 吸管 。

　　6 . 2 . 4 移液器吸头。

　　6 . 3 试剂

　　6.3. 1 DMEM培养基和 0.25%胰酶溶液(见附录 A)。

　　6 . 3 . 2 磷酸盐缓冲液。

　　6 . 3 . 3 仓鼠肾细胞系(BHK-21)或猪肾细胞系(PK-15)细胞。

　　6 . 3 . 4 犊牛血清。

　　6 . 3 . 5 青霉素 。

　　6 . 3 . 6 链霉素 。

　　6 . 4 操作步骤

　　6 . 4 . 1 病料采集

　　对死亡病畜或活体送检处死的动物，采集脑组织(应含有三叉神经节)、肺脏和扁桃体等组织，2 ℃ ~ 8 ℃冷藏条件下运输送检。

　　6 . 4 . 2 样品处理

　　待检组织(可等体积混样或单独处理)剪碎并匀浆后，与 DMEM 制成 1 ∶ 5 悬剂，反复冻融 3 次 ， 10 000 × g 离心 10 min后，取上 清 液 加 双 抗(青 霉 素 溶 液 终 浓 度 为 300 IU/mL、链 霉 素 终 浓 度 为 100 μg/mL)过夜或 4 ℃处理 4 h,再经孔径为 0 . 45 μm 滤膜过滤，-80 ℃保存作为接种材料。

　　6 . 4 . 3 病料接种细胞

　　将病料滤液接种至已长成单层的 BHK-21 细胞(或 PK-15 细胞)，接种量为所加培养液量的 1/10, 37 ℃恒温箱中吸附 1 h,加入含 10%犊牛血清(血清要求无支原体污染，预先经 56 ℃水浴灭活 30 min后使用)的 DMEM培养液，置 37 ℃ 、5% CO 2 培养箱中培养，逐日观察细胞病变。

　　6 . 4 . 4 结果判定

　　接种后 36 h~72 h,如细胞出现变圆、拉网、脱落等现象，可初步判定阳性(病料中含有伪狂犬病病毒)。如第一次接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后，按 6 . 4 . 3 盲传 3 代，如仍无细胞病变，判为阴性(病料中无伪狂犬病病毒)。

　　6 . 4 . 5 病毒鉴定

　　将出现细胞病变的细胞培养物，用已知的伪狂犬病毒阳性血清做病毒中和试验鉴定病毒，用聚合酶链式反应(第 7 章)或家兔感染试验(第 8 章)进一步鉴定。

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　　7 聚合酶链式反应

　　7 . 1 仪器

　　7 . 1 . 1 组织匀浆机(或研钵)。

　　7 . 1 . 2 高速冷冻离心机。

　　7 . 1 . 3 生物安全柜。

　　7 . 1 . 4 PCR仪 。

　　7 . 1 . 5 凝胶成像系统。

　　7 . 1 . 6 水浴锅 。

　　7 . 1 . 7 分析天平 。

　　7 . 1 . 8 微量移液器。

　　7 . 2 耗材

　　7 . 2 . 1 移液器吸头。

　　7 . 2 . 2 EP 管 。

　　7 . 2 . 3 PCR反应管。

　　7 . 3 试剂

　　7 . 3 . 1 DNA提取试剂盒。

　　7 . 3 . 2 琼脂糖 。

　　7 . 3 . 3 TEN缓冲液(见附录 A) 。

　　7 . 3 . 4 溴化乙锭(EB)(见附录 A)或新型核酸染料(EB替代物)。

　　7 . 4 引物序列

　　7 . 4 . 1 伪狂犬病病毒 gD基因检测

　　引物 序 列：上 游 引 物 P1 : 5′-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3′, 下 游 引 物 P2 : 5′-GTCCACG

　　CCCCGCTTGAAGCT-3′。扩增靶序列是伪狂犬病病毒 gD基因 434~650 nt 间的片段，扩增产物大小217 bp。 可用于检测伪狂犬病病毒，但不能区分猪伪狂犬病基因缺失活疫苗株和野毒株。

　　7 . 4 . 2 伪狂犬病病毒 gE基因检测

　　引物 序 列：上 游 引 物 P3 : 5′-TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG-3 , 下 游 引 物 P4 : 5′-TTT

　　GAATTCTTACGACACGGCGTCGCA-3′,扩增靶序列是伪狂犬病病毒 gE 基因 79 ~ 446 nt 间的片段，扩增产物大小为 368 bp,能区分猪伪狂犬病 gE基因缺失活疫苗株和野毒株。

　　7 . 5 操作步骤

　　7 . 5 . 1 样品的采集

　　对于病死或剖杀的动物，取脑组织(含三叉神经节)、扁桃体等组织;对于待检活猪，用灭菌棉签伸入猪鼻腔中(以棉签棉花部分全部插入鼻腔为准)，同一方向转动 3 次，获取鼻黏液，即为鼻拭子;用扁桃体取样器采集成年种猪扁桃体;采集公猪精液(检测前需用灭菌 PBS做 10 倍稀释)。4 ℃ ~8 ℃冷藏条件下运输送检。

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　　7 . 5 . 2 样品处理与模板制备

　　组织病料用组织匀浆器或研钵处理后，按 1 ∶ 5 比例用 TEN缓冲液(见附录 A. 3)充分混悬，收集于离心管内，反复冻融 3 次，10 000 × g 离心 10 min;鼻拭子样品，则加入 1 mL TEN 缓冲液涡旋 10 min后挤压棉签，混悬液 10 000 × g 离心 5 min,取上清液;精液样品，先用 PBS做 10 倍稀释，方可用于核酸提取。

　　取组织或鼻拭子样品的上清液或稀释好的精液，按 DNA试剂盒说明书提取 DNA模板，- 20 ℃贮存备用。

　　7 . 5 . 3 聚合酶链式反应(PCR)的操作程序

　　7 . 5 . 3 . 1 扩增伪狂犬病 gD基因 PCR反应体系

　　总体积 25.0 μL, MIX 12.5 μL, 引物 P1、P2 各 1.0 μL(10 μmol/L) , H2 O 5.5 μL, DNA模板 5.0 μL。扩增条件为：94 ℃预变性 5 min; 94 ℃ 30 s, 65 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35 个循环后 72 ℃延伸 10 min。

　　7 . 5 . 3 . 2 扩增伪狂犬病 gE基因 PCR反应体系

　　总体积 25.0 μL, MIX 12.5 μL, 引物 P3、P4 各 1.0 μL(10 μmol/L) , H2 O 5.5 μL, DNA模板 5.0 μL。扩增条件为：94 ℃预变性 5 min; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35 个循环后 72 ℃延伸 10 min。

　　7 . 5 . 4 PCR产物的检测与判定

　　7.5.4. 1 将 8 μL~10 μL PCR扩增产物加入含有溴化乙锭(EB) 或新型核酸染料(作为 EB 替代物)的1%琼脂糖凝胶的各电泳孔中(设阳性和阴性样品扩增对照孔)，电泳后，在凝胶成像系统或紫外光下观察结果。

　　7 . 5 . 4 . 2 当阳性对照和被检样品的扩增产物大小为 217 bp(必要时需要测序，目的序列参见附录 D) ,可判定为伪狂犬病病毒阳性，但不能区分 gE基因缺失疫苗毒株和野毒株。

　　7 . 5 . 4 . 3 当阳性对照和被检样品的扩增产物大小为 368 bp(必要时需要测序，目的序列参见附录 D) ,可判定被检样品为伪狂犬病病毒野毒阳性。 如不出现该扩增产物，但满足 7 . 5 . 4 . 2 中的阳性结果，判定被检样品为 gE基因缺失疫苗毒株，否则，判为扩增反应失败。

　　8 家兔感染试验

　　8 . 1 试验目的及生物安全要求

　　本法用于疑似伪狂犬病患病动物组织检测和分离病毒的鉴定。 要求在有良好隔离条件和消毒措施的动物房实施，试验结束后要对场地和用具实施彻底消毒。

　　8 . 2 家兔的选择

　　选择健康成年家兔(至少 4 只)，经血清中和试验或胶乳凝集试验证实为伪狂犬病病毒抗体阴性。

　　8 . 3 病料的采集、处理及接种

　　无菌采集病猪扁桃体或患病动物脑组织(含有三叉神经节)，用生理盐水或 PBS液制成 20%~30%匀浆液，反复冻融 3 次后 10 000 × g 离心 10 min,取 1 mL~2 mL上清液颈部皮下接种家兔(2 只);如接种物为疑似伪狂犬病病毒的细胞培养物，则取 1 mL~2 mL, 同样皮下接种家兔(2 只)。 同时设立接种等量生理盐水或 PBS或培养基的对照家兔。

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　　8 . 4 结果观察和判定

　　8 . 4 . 1 伪狂犬病病毒阳性

　　接种后 24 h~48 h,家兔在注射部位出现奇痒，表现为家兔舔( 啃)咬注射局部，导致皮肤溃烂;呼吸困难、尖叫、四肢麻痹、痉挛等症状，病程 2 d~5 d,最终死亡。 对照家兔无任何临床症状，健活。 可初步判定病料或细胞培养物中含有伪狂犬病病毒。

　　8 . 4 . 2 伪狂犬病病毒阴性

　　在接种后 1 周，病料悬液或细胞培养物接种家兔不出现任何症状，健活;同时，对照家兔无任何临床症状，健活。 可判定病料(或细胞培养物)中不含伪狂犬病病毒。

　　9 综合判定

　　当 5 . 4 . 4 . 8 结果阳性，可判定为猪伪狂犬病野毒感染抗体阳性;当 7 . 5 . 4 . 2 结果为阳性，可判定为伪狂犬病野毒病原阳性。 其余各项结果为阳性，可判断为伪狂犬病病毒感染(或免疫)阳性，但无法区分是疫苗毒株还是野毒株所致。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　细胞培养和 PCR反应常用溶液配制

　　A.1 DMEM 培养液配制

　　A.1 . 1 量取去离子水 950 mL,置于一定的容器中。

　　A.1 .2 将 10.0 g DMEM粉剂加于 15 ℃ ~30 ℃的去离子水中，边加边搅拌。

　　A.1 .3 每 1 000 mL培养液加 3.7 g碳酸氢钠(NaHCO3)。

　　A.1 .4 加水至 1 000 mL,用 1 mol/L NaOH 或 HCl 调 pH 值至 6.9~7.0,在过滤前应盖紧容器瓶塞。

　　A.1 .5 用 0 . 22 μm 的微孔滤膜正压过滤除菌。 4 ℃保存备用。

　　A.2 0.25%胰酶溶液配制

　　胰蛋白酶 250 . 00 mg 加入 100 mL Hanks 液中，充分溶解后，用 0 . 22 μm 的微孔滤膜正压过滤除菌，-20 ℃保存。

　　A.3 TEN 缓冲液配制

　　依次称量下列成分，充分混合溶解，即可。

　　三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 8.0) 1 210.00 mg(10 mmol/L)

　　乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.0) 372.00 mg(1.0 mmol/L)

　　三蒸水 1 000 mL

　　A.4 溴化乙锭溶液配制

　　溴化乙锭 1 . 0 g

　　三蒸水 100 mL

　　用磁力搅拌器搅拌数小时以确保其溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，室温保存。

　　注：溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。 建议采用 EB替代物作为本反应扩增产物的显色剂。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　病毒半数细胞培养感染量(TCID50)和血清中和抗体(NA)的计算(按 Reed-Muench法)

　　B.1 病毒半数细胞培养感染量(TCID50)

　　TCID50 指在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathic effect, CPE)所需的病毒量。

　　B.2 TCID50 计算方法

　　B.2 . 1 距离比的计算

　　按式(B. 1)计算距离比(D)：

　　D …………………………( B.1 )

　　式中：

　　CX —高于 50%病变百分数;

　　Dx —低于 50%病变百分数。

　　B.2.2 TCID50 的计算

　　按式(B. 2)计算 TCID50 :

　　- lgTCID50 = Ex + Fx …………………………( B.2 )

　　式中：

　　Ex —高于 50%病变率所对应的最高稀释度的对数;

　　Fx —距离比 ×(低于 50%病变率所对应的最低稀释度的对数与高于 50%病变率所对应的最高稀释度的对数之差)。

　　B.2.3 TCID50 计算方法示例

　　接种后细胞病变累计的计算方法数据演示见表 B. 1 。

　　表 B.1 接种后细胞病变累计的计算方法数据演示

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　　表 B.1(续)

　　从表 B. 1 可见，该病毒的 TCID50 在 10 - 6 (84 . 600) 和 10 - 7 (45 . 400) 之间，首先按式(B. 1) 计算距离比：

　　距离比

　　将式(B. 1)计算的距离比数值带入式(B. 2)计算 TCID50 :

　　- lgTCID50 = - 6 + 0.88 × (- 1) = - 6.88

　　所以：TCID50=10-6.88 /0.1 mL

　　B.3 血清中和抗体(NA)计算方法

　　B.3 . 1 距离比的计算

　　按式(B. 3)计算距离比(犇)：

　　犇 …………………………( B.3 )

　　式中：

　　犆X —高于 50%保护率的百分数;

　　犇x —低于 50%保护率的百分数。

　　B.3 . 2 中和抗体的计算

　　按式(B. 4)计算中和抗体(NA) :

　　- lgNA = 犈x + 犉x …………………………( B.4 )

　　式中：

　　犈x —高于 50%保护率所对应的最高血清稀释度的对数;

　　犉x —距离比 ×(低于 50%保护率所对应的最低稀释度的对数与高于 50%保护率所对应的最高稀释度的对数之差)。

　　B.3 . 3 血清中和抗体效价计算方法示例

　　接种后细胞病变累计的计算方法示例见表 B. 2 。

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　　表 B.2 接种后细胞病变累计的计算方法数据演示

　　从表 B. 2 可见，该血清的稀释度在 10-1.2 (83)和 10-1.8 (40)之间，首先按式(B. 3)计算距离比：

　　将按式(B. 3)计算的距离比数值按式(B. 4)计算中和抗体效价。

　　= - 1.2 + 0.7 × (- 0.6) = - 1.66

　　- 1.66 的反对数 =1/46

　　即 1 ∶ 46 稀释的待检血清可保护 50%的组织培养细胞免于出现 CPE。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　酶联免疫吸附试验有关溶液的配制

　　C.1 洗涤液

　　洗涤液为含 0 . 05%吐温-20(Tween-20)pH 7 . 4 的磷酸盐缓冲液，配制方法如下：

　　将下列试剂依次加至容积为 1 000 mL容器中，充分溶解即成。

　　C.2 抗原包被液

　　包被液为 25 mmol/L、pH 9 . 6 碳酸盐冲液，配制方法如下：

　　在 100 mL洗涤液中加入 0 . 1 g 牛血清白蛋白(BSA)即可。

　　C.4 底物溶液

　　C.4. 1 PH 5.0 磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液

　　将下列试剂依次加入 1 000 mL体积的容器中，充分溶解即成。

　　C.4 . 2 0 . 75% H2o2

　　取 30% H2 O2 1.25 mL,加入蒸馏水，使总体积达到 50 mL。

　　C.4.3 四甲基联苯胺(TMB)母液

　　取 200.00 mg TMB溶解于 100 mL无水乙醇中。-20 ℃保存。

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　　C.4 . 4 底物溶液(临用时配制)

　　0.1 mol/L pH 5.0 磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液 9.5 mL TMB母液 0.5 mL

　　0.75% H2 O2 42 μL此底物液对光敏感，应避免强光照射。 现配现用。

　　C.5 终止液

　　C.6 样品稀释液

　　样品稀释液为 0 . 1 mol/ L pH 7 . 4 磷酸盐缓冲液，配制方法如下：

　　将下列试剂依次加至容积为 1 000 mL 的容器中：

　　氯化钠 (NaCl) 8.02 g

　　氯化钾(KCl) 0.20 g

　　十二水合磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ·12H2 O) 3.87 g

　　磷酸二氢钾(KH2 PO4) 0.16 g

　　加蒸馏水定容至 1 000 mL

　　混匀后，充分溶解，最后加入 0 . 10 g叠氮钠(NaN3) 防腐(其终浓度为 0 . 1 g/L) 。

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　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　伪狂犬病病毒 gD基因和 gE基因的 PCR扩增序列

　　D.1 伪狂犬病病毒 PCR 目的 gD基因扩增产物 DNA序列

　　CAGGAGGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGGCCCCGGGGCGGTTCAACGAGGGCCAGT ACCGGCGCCTGGTGTCCGTCGACGGCGTGAACATCCTCACCGACTTCATGGTGGCGCTCCCC GAGGGGCAAGAGTGCCCGTTCGCCCGCGTGGACCAGCACCGCACGTACAAGTTCGGCGCGTG CTGGAGCGACGACAGCTTCAAGCGGGGCGTGGACA

　　D.2 伪狂犬病病毒 PCR 目的 gE基因扩增产物 DNA序列

　　CCATGCGGCCCTTTTTGCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCT CCACCGAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTC CCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGACGACGATGACCTCAACGGCGAC CTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCC CCGGCCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGG CGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCG