GB/T 18647-2020 动物球虫病诊断技术

　　ICS 1 1 . 220 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 18647—2020

　　代替 GB/T 18647—2002

　　动物球虫病诊断技术

　　Diagnostictechniquesforanimalcoccidiosis

　　2020-12-14 发布 2020-12-14 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 18647—2020

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准代替 GB/T 18647—2002《动物球虫病诊断技术》。 本标准与 GB/T 18647—2002 相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：

　　—“范围”部分增加了家畜(猪、牛、羊、马等)和宠物(犬、猫等)(见第 1 章);

　　— 增加了“临床诊断”部分(见第 3 章);

　　—“病原检查”部分增加了“样品采集、保存和运输”(见 4 . 2) ;

　　—“定性检查”和“定量检查”部分增加了不同动物粪便处理的方法(见 4 . 3 . 1 . 2 和 4 . 3 . 2 . 3) ;

　　—“定性检查”阴性结果判定部分根据不同动物修改了需要连续检查粪便天数[见 4 . 3 . 1 . 8 b) , 2002 年版的 2.2.1.8 b)] ;

　　—“定量检查”部分增加了不同动物粪便采集量以及卵囊 OPG 的换算方法(见 4 . 3 . 2 . 2 , 4 . 3 . 2 . 7 ~ 4 . 3 . 2 . 9) ;

　　—“病理检查”中裂殖子/裂殖体检查部分增加了对兔肝脏和鸭、鹅肾脏的检查(见 5 . 3 . 1) ;

　　— 增加了结果“综合判定”部分(见第 6 章);

　　—“球虫卵囊形态特征”部分增加了不同属球虫卵囊的大小和模式图(见附录 B) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

　　本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口 。

　　本标准起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所。

　　本标准主要起草人：董辉、黄兵、韩红玉、陈兆国、赵其平、朱顺海。

　　本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

　　—GB/T 18647—2002

　　GB/T 18647—2020

　　引 言

　　球虫病(coccidiosis)是多种动物的一种重要寄生虫病，各国均有发生，对家畜、家禽、宠物、鱼类和野生动物等均有不同程度的危害，特别在集约化养殖中，若控制不严，会造成重大经济损失。 本病对家禽和兔危害较大，急性暴发的死亡率可超过 30%;其次是猪、牛 、羊等家畜，急性感染常引起下痢，生长严重受阻;犬、猫球虫病也较为常见，可引起消瘦、贫血、腹泻及生长发育受阻，严重时可导致死亡;也偶有鱼类和野生动物发生球虫病的报道。

　　本病的病原为顶复器门(Apicomplexa)、类椎体纲 (Conoidasida)、真球虫 目 (Eucoccidiorida)、艾美耳科 ( Eimeriidae) 中 的 艾 美 耳 属(Eimeria)、等 孢 属(Isospora)、泰 泽 属(Tyzzeria)、温 扬 属

　　(wenyonella)球虫。 每种动物都有各 自特有的球虫种类，文献记录的畜禽和野生动物球虫种类已达2 000多种。 国内外对球虫病的经典诊断方法是病原检查，并结合临床症状和病理剖检进行综合诊断。尽管国内外学者建立了免疫学、血清学和分子生物学等多种诊断技术，如色素试验法、子孢子制动反应、间接血凝试验、免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫细胞化学技术、随机引物扩增多态性 DNA(RAPD)和聚合酶链式反应(PCR) 等，但由于这些方法检出的准确性和操作复杂等问题，尚不能代替现有方法。

　　病原检查和综合诊断技术仍是目前最常用的方法。 综合诊断主要用于发病或死亡后的诊断，确定动物或动物群是否因感染球虫而发病或死亡。 病原检查简单、易行，既可定性，又可定量，既可用于发病前，又可用于发病后，以确定动物或动物群感染球虫的程度。 病原检查可广泛用于流行病学调查、防治药物的筛选和临床验证、进出口检疫、无本病健康动物群的建立等。

　　为了规范球虫与球虫病的检疫方法，使得检出结果客观、准确、一致，以保证《中华人民共和国动物防疫法》的实施，特制定本标准。

　　GB/T 18647—2020

　　动物球虫病诊断技术

　　1 范围

　　本标准规定了动物球虫病的临床诊断、病原检查、病理检查、综合判定的技术要求。

　　本标准适用于家禽(鸡、鸭、鹅等)、家畜(猪、牛、羊、马、兔等)、宠物(犬、猫等)球虫病(感染)的诊断。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法

　　NY/T 541—2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

　　3 临床诊断

　　根据发病临床特征，球虫病可分为急性型和慢性型。

　　急性型多发生于幼龄动物，病程初期表现为精神沉郁，嗜睡，被毛粗乱，食欲下降，腹泻。 病程后期出现运动失调，食欲废绝，排出带血水样稀便，甚至是血便，具恶臭味，可视黏膜贫血、苍白，身体消瘦，甚至失重，最后因脱水、衰竭而死。

　　慢性型多见于大龄动物，无明显症状，主要表现为厌食，间歇性下痢，逐渐消瘦，生产性能下降等。有以上临床症状者，可以怀疑为球虫病，确诊需进一步进行病原或病理检查。

　　4 病原检查

　　4 . 1 材料与试剂

　　4 . 1 . 1 试剂：饱和盐水，2 . 5%重铬酸钾溶液，配制方法分别见附录 A 中 A. 1 和 A. 2,配制用水符合GB/T 6682—2008 三级水要求。

　　4 . 1 . 2 器材：样品保存袋、记号笔、防水标签纸、60 目和 100 目铜丝网或尼龙网、100 mL量筒、50 mL烧杯、50 mL 离心管、10 mL 玻璃瓶、吸管、镊子、天平、离心机、麦氏虫卵计数板、载玻片、盖玻片、显微镜等。

　　4 . 2 样品采集、保存和运输

　　4 . 2 . 1 动物粪便的采集：对家禽、犬、猫、兔等小型动物，若是群体采样，采集新鲜粪便不少于 200 g,若是个体采样，采集新鲜粪便不少 60 g;对猪、牛 、羊 、马等大型动物，若是群体采样，采集新鲜粪便不少于300 g,若是个体采样，采集新鲜粪便不少 100 g。

　　4 . 2 . 2 样品的保存：样品采集后置于样品保存袋中，封口后，每份样品的包装袋上均要贴上标签，写明采集地点、采集时间、动物种类、动物年龄、粪便性状等详细资料，置于 2 ℃ ~8 ℃冰箱内保存。

　　4 . 2 . 3 样品的运输：以最快最直接的途径将所采集的样品送往实验室进行检测，运输条件符合 NY/T 541— 2016要求。

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　　4 . 3 操作方法

　　4 . 3 . 1 定性检查

　　4 . 3 . 1 . 1 将被检动物或动物群的新鲜粪便充分搅匀后取 10 g,放入 50 mL烧杯中，加入适量水。

　　4 . 3 . 1 . 2 轻轻搅匀，经 60 目铜丝网或尼龙网过滤;对于猪、牛、羊、马等大型动物，滤液再经 100 目铜丝网或尼龙网过滤。

　　4.3. 1 .3 将滤液移入 50 mL试管，2 500 r/min离心 10 min。

　　4 . 3 . 1 . 4 倾去上清液，沉淀物中加入少量饱和盐水，混匀，将管内的沉淀物混悬液移入 10 mL 玻璃瓶内。

　　4 . 3 . 1 . 5 用饱和盐水加满玻璃瓶，盖上盖玻片(盖玻片应与液面接触)，静置 10 min。

　　4 . 3 . 1 . 6 取下盖玻片，将有液体的一面盖在载玻片上。

　　4 . 3 . 1 . 7 置载玻片于显微镜载物台上，用 10 × 10 或 10 × 40 的倍数进行检查。

　　4 . 3 . 1 . 8 定性检查的判定标准如下：

　　a) 发现球虫卵囊，判为阳性，说明该动物(群)已感染球虫。 将球虫阳性粪样置于 2 . 5%重铬酸钾溶液中，在 25 ℃ ~28 ℃环境中培养至孢子化卵囊后，参见附录 B球虫卵囊形态特征，确定为哪一属的球虫。

　　b ) 未发现球虫卵囊，需从 4 . 3 . 1 . 1 开始重复检查 5 次，仍未见球虫卵囊，该粪样可判为阴性。 对于家禽、犬、猫等，需连续采集粪便 7 d~ 10 d, 每天检查，均未发现球虫卵囊，方可说明该动物(群)未感染球虫;而对于猪、牛、羊、马、兔等家畜，需连续采集粪便 14 d~21 d,每天检查，均未发现球虫卵囊，说明该动物(群)未感染球虫。

　　4 . 3 . 2 定量检查

　　4 . 3 . 2 . 1 对定性检查中呈阳性的粪样，需进行定量检查。

　　4 . 3 . 2 . 2 每份粪样取 3 个重复，每个重复根据待检动物种类不同取不同粪便量，家禽、犬、猫、兔等小型动物取粪样 2 g,猪 、牛 、羊 、马等大型动物取粪样 10 g,放入 50 mL烧杯。

　　4 . 3 . 2 . 3 加入适量自来水搅匀，经 60 目铜丝网或尼龙网过滤，用少量自来水冲洗 3 次 ~5 次滤网;对于猪、牛、羊、马等大型动物，滤液再经 100 目铜丝网或尼龙网过滤，用少量自来水冲洗 3 次 ~5 次滤网。

　　4.3.2.4 将滤液移入 50 mL试管，2 500 r/min离心 10 min,弃去上清液。

　　4 . 3 . 2 . 5 用少量饱和盐水将沉淀物搅匀，移入 100 mL量筒，加饱和盐水至 60 mL处，充分混匀。

　　4 . 3 . 2 . 6 用吸管吸取混悬液注满麦氏虫卵计数板的 2 个计数室，静置 5 min。

　　4 . 3 . 2 . 7 将麦氏虫卵计数板置于显微镜下检查，用 10 × 10 的倍数数出每个计数室( 1 cm × 1 cm × 0 . 15 cm=0 . 15 cm3 ) 内的所有卵囊数，将两个计数室的卵囊数之和除以 2 即得卵囊平均值。 对压线的卵囊，按左、上压线计，右、下压线不计处理。 根据每个重复的卵囊平均值，计算出三个重复的平均值 犃。

　　4 . 3 . 2 . 8 家禽、犬 、猫 、兔等动物的每克粪便卵囊数(oocyst per gram, OPG)按式(1) 计算，猪、牛、羊、马等动物的 OPG按式(2)计算：

　　4 . 3 . 2 . 10 定量检查的判定标准如下：

　　a) OPG>10×104 , 为严重感染;

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　　b) 1×104 ≤OPG≤10×104 , 为中度感染;

　　c) OPG<1×104 , 为轻度感染。

　　5 病理检查

　　5 . 1 材料准备

　　5 . 1 . 1 磷酸盐缓冲液(PBS),配制方法见 A. 3,配制用水符合 GB/T 6682—2008 三级水要求。

　　5. 1 .2 50 mL或 100 mL烧杯、吸管、手术剪刀、镊子、玻片、盖玻片、显微镜、研钵等。

　　5 . 1 . 3 疑为发生球虫感染致死或将要死亡的动物。

　　5 . 2 病变检查

　　5 . 2 . 1 对疑为球虫感染致死或将要死亡的动物进行解剖，观察病变情况。

　　5 . 2 . 2 主要检查球虫寄生部位(器官)的病变。 大多数的球虫寄生于肠上皮细胞，若肠道明显肿大、胀气或变形，肠浆膜面出现针尖大小、颜色为鲜红色、褐色或白色的斑点或斑块或结节;肠内容物充满血凝块、脱落的上皮细胞、纤维素样物、黏液等，呈暗红色、橙黄色或乳白色，多为稀薄状;肠黏膜增厚，有坏死的病灶等，可疑为球虫病，进一步做裂殖子、裂殖体或卵囊检查。

　　5 . 2 . 3 对兔，还应检查肝脏;对鸭、鹅，还应检查肾脏;若这些脏器上有灰白色的斑点或斑块，可疑为球虫病，进一步做裂殖子、裂殖体或卵囊检查。

　　5 . 3 裂殖子/裂殖体检查

　　5 . 3 . 1 取病变明显的肠道，纵向剪开，用磷酸盐缓冲液轻轻洗去黏膜表层的杂物，刮取少许黏膜;对兔或鸭、鹅，还应分别刮取肝脏或肾脏灰白色的斑点或斑块。

　　5 . 3 . 2 将刮取物放在载玻片上，滴 1 滴 ~2 滴磷酸盐缓冲液，加盖玻片，置于显微镜载物台上。

　　5.3.3 在高倍镜下观察，如见有大量球形的像剥了皮的橘子似的裂殖体(直径大多为 10 μm~50 μm)和香蕉形或月牙形的裂殖子(大小大多为 5 μm~8 μm×2 μm~3 μm),判为球虫感染。

　　5 . 4 卵囊检查

　　5 . 4 . 1 将病变明显的肠道，纵向剪开，取少量内容物，放在载玻片上，滴 1 滴 ~2 滴磷酸盐缓冲液，加盖玻片，轻轻将内容物压散，置显微镜下检查，若见大量球虫卵囊(形态参见附录 B),判为球虫感染。

　　5 . 4 . 2 或取有灰白色斑点或斑块的肠道，纵向剪开，用磷酸盐缓冲液轻轻洗去黏膜表层的杂物，刮取少许有灰白色斑的黏膜，放在载玻片上，滴 1 滴 ~2 滴磷酸盐缓冲液，加盖玻片，轻轻将黏膜内容物压散，置显微镜下检查，若见大量球虫卵囊，判为球虫感染。

　　5 . 4 . 3 对疑为兔或鸭、鹅的球虫病，从有灰白色斑点或斑块的肝脏或肾脏上，剪取少量病变组织，放在研钵内，加适量磷酸盐缓冲液，充分研磨。 取 1 滴研磨液在载玻片上，加盖玻片，置显微镜下检查，若见大量球虫卵囊，判为球虫感染。

　　6 综合判定

　　6 . 1 疑似

　　凡出现第 3 章的临床症状和/或符合 5 . 2 的病变特征，可判为球虫病疑似病例。

　　6 . 2 确诊

　　凡符合 5 . 2 的病变特征，并满足 5 . 3 和/或 5 . 4 中检查结果为球虫感染，或粪便定量检查结果满足

　　4 . 3 . 2 . 10中 a)或 b) 时，可判为球虫病病例。

　　GB/T 18647—2020

　　附 录 A (规范性附录)试剂及其配制

　　A.1 饱和盐水配制

　　称取 400 g食盐，放入三角烧瓶中，加入 1 000 mL水，加热烧瓶至沸腾，充分搅拌后冷却至室温，有少量盐析出，即为饱和盐水，密度约 1 . 18 g/cm3 。

　　A.2 2 . 5%重铬酸钾溶液配制

　　称取 25 g重铬酸钾固体，放入 1 L烧杯中，加入开水至 1 000 mL 刻度处，充分搅拌使重铬酸钾完全溶解后，冷却至室温，即为 2 . 5%重铬酸钾溶液。

　　A.3 磷酸盐缓冲溶液(PBS)配制

　　将下列试剂按次序加入到 1 000 mL定量瓶中。

　　氯化钠氯化钾

　　磷酸氢二钠

　　磷酸二氢钾蒸馏水

　　8 . 00 g

　　0 . 20 g

　　1 . 44 g

　　0 . 24 g 800 mL

　　充分搅匀，用适量 1 mol/ L 盐酸(HCl) 调溶液的 pH 值至 7 . 4,再加蒸馏水定容至 1 L。 分装至500 mL或 250 mL 的玻璃瓶中，在 103.41 kPa压力下蒸气灭菌 20 min,室温保存。

　　GB/T 18647—2020

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　球虫卵囊形态特征

　　B.1 球虫卵囊呈椭圆形、圆形、卵圆形或梨形等不同的形态，均有卵囊壁。

　　B.2 未发育成熟的卵囊称为未孢子化卵囊，其颗粒状的原生质多数呈圆形，位于卵囊中间[图 B. 1 中a)] 。

　　B.3 发育成熟的卵囊称为孢子化卵囊，因属不同，其内含的孢子囊和子孢子数不相同：

　　a) 艾美耳属(Eimeria)球虫卵囊内有 4 个孢子囊，每个孢子囊含 2 个子孢子[图 B. 1 中 b)],卵囊大小大多为(15 μm~40 μm) × (10 μm~30 μm)。

　　b ) 等孢属(Isospora)球虫卵囊内有 2 个孢子囊，每个孢子囊含 4 个子孢子[图 B. 1 中 c)],卵囊大小大多为(15 μm~40 μm) × (10 μm~30 μm)。

　　c) 泰泽属(Tyzzeria)球虫卵囊内没有孢子囊，内含 8 个子孢子[图 B. 1 中 d)], 卵囊大小大多为(10 μm~20 μm) × (10 μm~15 μm)。

　　d) 温扬属(wenyonella)球虫卵囊内有 4 个孢子囊，每个孢子囊含 4 个子孢子[图 B. 1 中 e)],卵囊大小大多为(15 μm~30 μm) × (10 μm~20 μm)。

　　a)未孢子化卵囊 b)艾美耳属孢子化卵囊 c)等孢属孢子化卵囊

　　d)泰泽属孢子化卵囊 e)温扬属孢子化卵囊

　　图 B.1 不同属球虫卵囊的模式图