GB/T 18649-2014 牛传染性胸膜肺炎诊断技术

　　ICS 11. 220 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 18649—2014代替 GB/T 18649—2002

　　牛传染性胸膜肺炎诊断技术

　　Diagnostictechniquesofcontagiousbovinepleuropneumonia

　　2014-09-30发布 2015-03-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　中 华 人 民 共 和 国

　　国 家 标 准

　　牛传染性胸膜肺炎诊断技术

　　GB/T 18649—2014

　　*

　　中 国 标 准 出 版 社 出 版 发 行

　　北京市朝阳区和平里西街甲 2 号(100029)

　　北京市西城区三里河北街 16号(100045)

　　网址:www. gb168. cn

　　服务热线 :400-168-0010

　　010-68522006

　　2014年 9 月第一版

　　*

　　书号 : 155066 · 1-49775

　　版权专有 侵权必究

　　GB/T 18649—2014

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准代替 GB/T 18649—2002《牛传染性胸膜肺炎(牛肺疫)诊断技术》。本标准与 GB/T 18649— 2002相比 ,主要技术变化如下 :

　　— 删除了其中的微量凝集试验 ;

　　— 修改了其中的补体结合试验 ;

　　— 增加了聚合酶链式反应(PCR)检测方法和 C-ELISA检测方法 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 。

　　本标准主要起草人 :辛九庆 、李媛 。

　　本标准所代替标准的历次版本发布情况为 :

　　—GB/T 18649—2002。

　　牛传染性胸膜肺炎诊断技术

　　1 范围

　　本标准规定了 牛 传 染 性 胸 膜 肺 炎 的 病 原 学 检 查 、聚 合 酶 链 式 反 应 (PCR) 、补 体 结 合 试 验 、竞 争ELISA(C-ELISA)试验诊断技术要求 。病原学检查和聚合酶链式反应(PCR) 适用于急性 、亚急性及慢性病牛的病原诊断 ,补体结合试验和竞争 ELISA(C-ELISA)试验适用于牛传染性胸膜肺炎感染牛的抗体检测 。

　　本标准适用于口岸 、产地及集散地 、养殖企业或养殖户对牛传染性胸膜肺炎的诊断 。

　　2 流行病学

　　健康牛和病牛接触 , 由呼吸道吸入病牛的 “飞沫 ”是本病的主要传染途径 。在该病的常在地区多见亚急性和慢性病程 , 以地方流行性为特点 。但在新发生本病地区以急性经过为主 。慢性病牛长期带菌 ,成为隐蔽的传染源 。

　　3 临床症状

　　暴发流行时多呈急性病程 ,体温在 41 ℃以上稽留 。 呼吸系统症状非常明显 ,表现为 : 呼吸困难 ,呈腹式呼吸 , 咳嗽弱而无力 ,有浆液或脓性鼻汁流出 。食欲废绝 。

　　4 病理变化

　　急性期病变以浆液渗出性纤维素性胸膜肺炎 , 间质多孔多汁 ,肺小叶出现各期肝变 、多色 ,呈大理石样肺 ,肺胸膜和肋胸膜粘连 , 以及胸腔渗出液大量潴留为特征 。转为慢性后逐渐形成肺包膜或坏死块 。

　　5 病原分离鉴定

　　5. 1 材料准备

　　10%马血清马丁肉汤和琼脂培养基 :见附录 A。

　　5.2 病料采集

　　用灭菌器械(注射器 、剪刀 、青霉素瓶 、棉拭子等)无菌采集关节液 、胸腔积液 、鼻腔拭子和全血 ,关节液和胸腔渗出液置于青霉素瓶内 。

　　5.3 病料的保存

　　病料均放入 4 ℃冰 箱 内 保 存 , 并 在 24 h 内 送 到 指 定 实 验 室 。 如 果 在 24 h 内 不 能 送 达 , 应 放 入-20 ℃冰箱内保存 。

　　5.4 培养方法

　　在无菌条件下吸取 胸 腔 渗 出 液 或 关 节 液 0. 1 mL~ 0. 3 mL 接 种 于 培 养 基 中 即 可 。 鼻 腔 拭 子 用

　　GB/T 18649—2014

　　5 mL灭菌生理盐水(含有 100 U/mL青霉素)浸泡 15 min后 , 吸取 0. 1 mL~ 0. 3 mL接种于培养基中即可 。

　　5.5 结果判定

　　5.5. 1 培养特征

　　5.5. 1. 1 培养性状和菌落形态

　　牛传染性胸膜肺炎病原在 10%马血清马丁肉汤内生长初期呈轻微浑浊或呈白色点状 、丝状生长 ,以后逐渐均匀混浊 ,半透明稍带乳光 ,不产生菌膜或沉淀 ,也无颗粒悬浮 。在含有 10%马血清的马丁琼脂培养基上生长迟 缓 , 为 极 小 的 水 滴 状 圆 形 略 带 灰 色 的 微 小 菌 落 , 中 央 有 乳 头 状 突 起 。 菌 落 直 径 约0. 2 mm~0. 5 mm , 肉眼不易看见 ,需用放大镜或低倍显微镜观察 。

　　5.5. 1.2 染色镜检

　　取马丁肉汤培养物涂片置于温箱中干燥后在酒精灯上轻微火焰固定 ,再用 3% ~ 5%铬酸蒸馏水溶液固定 1 min~ 2 min,水洗 ,浸入用蒸馏水稀释的 1 ∶ 30姬姆萨氏染液中染色 ,染液缸放入普通冰箱内过夜 。染色后取出用蒸馏水清洗 , 自然干燥后用 800倍 ~ 1 000倍显微镜观察 。菌型为多形态 , 以球点形最常见 ,大小在 125 nm~ 250 nm。

　　5.5.2 生化特征

　　5.5.2. 1 糖发酵试验

　　在进行糖发酵试 验 时 , 将 各 种 糖 培 养 基 管 (见 附 录 B) 加 无 菌 的 马 血 清 0. 2 mL, 再 加 被 检 菌 液0. 1 mL置 37 ℃下培养 5 d~ 7 d。

　　结果判定 :丝状支原体丝状 亚 种 SC 型 可 轻 度 分 解 葡 萄 糖 、麦 芽 糖 、糊 精 、淀 粉 , 产 酸 , 使 培 养 基 变黄 ,而不产气 ;不能分解果糖 、蕈糖 、半乳糖和水杨苷 。

　　5.5.2.2 硫化氢(H2S)试验

　　将被检菌液接种于 10%马血清马丁肉汤或琼脂斜面上 ,取一片乙酸铅滤纸条(见附录 C) ,夹在试管的棉塞下悬挂 ,置 37 ℃培养 5 d~ 7 d,滤纸条变黑或棕褐色为阳性反应 。

　　5.5.2.3 硝酸盐还原试验

　　向硝酸盐还原培养基(见附录 D 中 D. 1) 中加 10%无菌马血清 ,然后将被检菌液 0. 1 mL接种于硝酸盐还原培养基中 , 同时设不接种的对照 ,于 37 ℃培养 5 d~ 7 d。 于 5 d和 7 d 时取 1 mL培养液置于干净试管中 ,再各滴 0. 1 mL试剂甲液和乙液(见 D. 2) ,对照管同样加试剂 。

　　结果判定 :若试管菌液呈现红色或橙色者为阳性反应 ;如无红色出现 ,则可加 0. 1 mL二苯胺试剂 ,若呈现蓝色反应 ,则表示培养基中有硝酸盐存在 ;如不呈蓝色反应 ,表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐已被还原成其他物质 ,则仍判定为硝酸盐还原试验阳性反应 。

　　5.5.2.4 靛基质试验

　　向靛基质试验培养基(见附录 E 中 E. 1)中加入 10%无菌马血清 ,再将被检菌液 0. 1 mL接种于培养基中 ,37 ℃培养 5 d~ 7 d后 ,滴加试剂 0. 1 mL于培养物液面 ,轻轻摇动 ,红色为阳性反应 ,黄色为阴性反应 。

　　5.5.2.5 甲基红(MR)试验

　　按 10%的体积向甲基红(MR)试验培养基(见附录 F 中 F. 1) 中加入无菌马血清 ,再接种被检菌液0. 1 mL,37 ℃培养 。 于培养第五天时取 1 mL培养液于另一支试管中 ,并加 0. 1 mL试剂 ,如培养液呈现红色为 MR试验阳性 ;黄色者为阴性 ,继续培养至第七天 ,再进行试验 。

　　5.5.2.6 维培二氏(V-P)试验

　　可用下列三种试剂进行 V-P试验 :

　　a) Barritt’s试剂法

　　取被检菌液 2 mL加甲液 1 mL、乙液 0. 4 mL(见附录 G 中 G. 1) ,充分混合 ,在 5 min内呈粉红色反应为阳性 。

　　b) O’Meara’s试剂法

　　取被检菌液 2 mL加等量试剂(见 G. 2)混合 ,充分振荡试剂 ,在 5 min内呈现粉红色者为阳性反应 。 c) 硫酸铜试剂法

　　取被检菌液 2 mL加等量硫酸铜试剂(见 G. 3) 混合 , 充分振荡试剂 , 在 5 min 内呈粉红色反 应 为

　　阳性 。

　　上述三种方法为阴性 ,继续培养 ,再进行观察 。

　　6 聚合酶链式反应(PCR)

　　6. 1 材料与试剂

　　6. 1. 1 引物 。

　　6. 1. 1. 1 特异性引物 :SC1和 SC2为丝状支原体丝状亚种 SC型(MmmSC)特异性引物 。

　　6. 1. 1.2 引物序列 。

　　SC1:ATATACTTCTGTTCTAGTAATATG;

　　SC2:CTGATTATGATGACAGTGGTCA。

　　6. 1. 1.3 引物浓度 :浓度为 5 pmol/μL。

　　6. 1.2 Taq酶(5U/μL) 。

　　6. 1.3 电泳缓冲液(TAE) 。

　　6. 1.4 琼脂糖 :浓度为 1. 5% 。

　　6. 1.5 DNA分子质量标准 。

　　6.2 试验程序

　　6.2. 1 样品的采集与处理

　　6.2. 1. 1 组织样品的采集

　　参照 5. 2进行 。

　　6.2. 1.2 标准阳性样品的处理

　　用 1 mL马丁汤培养基(含 10%马血清 ,不含抗生素) 溶解冻干菌种后 ,加入 9 mL 马丁汤内 ,混匀后从中吸取 1 mL菌液加入到下一试管中 ,共稀释 9 管 ,另 1 管做空白对照 。置于 37 ℃培养箱内培养7 d~ 10 d,每日观察 ,待菌体个数达到每毫升 108 颜色变化单位(color change unit,CCU)时收获 。

　　6.2.2 基因组 DNA 的提取

　　使用商品化的基因组 DNA提取试剂盒 ,参照说明书进行操作 。

　　6.2.3 PCR反应

　　采用 20 μL反应体系 :

　　10×缓冲液 2. 0 μL

　　2. 5 mmol/L dNTPs 1. 6 μL

　　10 μmol引物 1 1. 0 μL

　　10 μmol引物 2 1. 0 μL

　　模板 DNA 1. 0 μL

　　10u/ μLTaq酶 0. 5 μL

　　纯水 12. 9 μL

　　总体积 20. 0 μL

　　瞬时离心 ,置 PCR仪内 进 行 PCR 循 环 。 95 ℃预 变 性 3 min;循 环 94 ℃ 45 s, 57 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min,35个循环后 72 ℃延伸 10 min。采用常规方法配制的 1. 5%琼脂糖进行制板并电泳检测 。

　　6.3 PCR产物的判定

　　6.3. 1 标准阳性样品扩增出 277 bp片段而空白对照不能扩增出任何条带 ,则 PCR 反应判定为有效 。如标准阳性样品不能扩增出 目的大小片段 ,或空白对照扩增出 目的片段 ,则反应无效 。

　　6.3.2 在 PCR反应有效的前提下 ,待检样品扩增出的 DNA 片段为 277bp,可判定待检样品为阳性 ,否则待检样品为阴性 。

　　7 补体结合试验

　　7. 1 材料准备

　　7. 1. 1 试验用巴比妥缓冲液 ,使用时作 1 ∶ 5稀释 ,配制方法见附录 H。

　　7. 1.2 绵羊红细胞悬液使用阿氏液 ,制备方法见附录 I。

　　7. 1.3 6%绵羊红细胞悬液制备见附录 J。

　　7. 1.4 抗原 、标准阳性血清 、阴性血清采用国际标准品,溶血素由兽医生物药品厂供应 ,按说明书使用 。溶血素效价滴定见附录 K。

　　7. 1.5 致敏绵羊红细胞制备 :使用 12单位 HD50 (50%溶血程度) 的溶血素与等体积的 6%绵羊红细胞混合 ,37 ℃水浴 30 min,期间间隔 5 min摇动一次 。

　　7. 1.6 补体效价滴定方法见附录 L。

　　7. 1.7 抗原效价滴定方法见附录 M。

　　7.2 操作方法

　　7.2. 1 被检血清 、标 准 阴 性 血 清 、阳 性 血 清 均 用 巴 比 妥 缓 冲 液 作 1 ∶ 10 稀 释 , 于 56 ℃水 浴 中 灭 活30 min。

　　7.2.2 在 96孔微量反应板中 ,每孔加入 25 μL抗原 、25 μL被检血清 、25 μL 2. 5 U 补体 , 振荡混匀后37 ℃水浴 30 min。

　　7.2.3 每孔加入 25μL致敏后的绵羊红细胞 ,振荡混匀后 37 ℃水浴 30 min。

　　7.2.4 设标准阳性血清 、阴性血清 、补体对照 、溶血素对照 、红细胞对照以及抗原抗补体活性对照 。具

　　体试验步骤见表 1。

　　表 1

　　7.3 结果判定

　　7.3. 1 96孔微量反应板 125g 离心 2 min或静止 10 min, 当所有对照成立的情况下 ,判定被检孔补体结合百分率 。

　　7.3.2 判定补体结合百分率方法见附录 N。

　　7.3.3 判定标准 :

　　当所有对照成立的情况下 ,判定 ++++为阳性 ; + 、++ 、+++为疑似 ; -为阴性 。

　　对于疑似样品需重新采集血清进行复检 ,如果仍为疑似 ,则应做病理学和病原学检查 。

　　8 竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)

　　8. 1 材料与试剂

　　使用从世界卫生组织指定生产商处购买的商品化试剂盒 。

　　8.2 试验程序

　　8.2. 1 将待检血清(1/10)和工作浓度单抗(稀释液为 pH7. 4 的 PBS,含 0. 5%马血清和 0. 05%的吐温20)各 50 μL加入各孔中 , 同时设立标准阴性血清 、标准强阳性血清 、标准弱阳性血清以及结合物对照孔 、单抗对照孔 。将 ELISA反应板置于摇床上 37 ℃反应 1 h,缓缓摇动 。

　　8.2.2 用 PBS溶液(pH7. 4, 内含 0. 05%的吐温 20) 冲洗 ELISA 板两次 , 向所有孔中加入 100 μL酶结合物 ,37 ℃反应 30 min。

　　8.2.3 用 PBS溶液(pH7. 4, 内含 0. 05%的吐温 20)冲洗 ELISA板三次 , 向所有孔中加入 100 μL底物 , 37 ℃反应 30 min。

　　8.2.4 向所有孔中加入 100 μL 2 mol/L H2SO4 终止反应 , 以 405 nm 波长读取 OD值 。

　　8.2.5 质量控制 :

　　a) 单抗对照孔(Cm) OD值应在 0. 5~ 2. 0 之间(最好接近于 1. 0) ;

　　b) 结合物对照孔(Cc) OD值应小于 0. 3;

　　c) 标准阴性血清(CN)抑制百分比应小于 35% ;

　　d) 标准弱阳性血清(CP+)抑制百分比在 50% ~ 80%之间 ;

　　e) 标准强阳性血清(CP++)抑制百分比在 60% ~ 90%之间 。

　　8.3 结果判定

　　8.3. 1 单个样品抑制率按式(1)计算 。

　　单个样品抑制率 = [单抗对照孔(Cm) 的 OD值 -样品的 OD值]/ ………( 1 )

　　8.3.2 被检样品抑制率等于或低于 40%为阴性 。

　　8.3.3 被检样品抑制率在 40% ~ 50% 之间为疑似 。

　　8.3.4 被检样品抑制率等于或大于 50%为阳性 。

　　8.3.5 对于疑似样品需重新采集血清进行复检 ,如果仍为疑似 ,则应做病理学和病原学检查 。

　　9 综合判定

　　本病的最终确诊需综合流行病学 、临床症状 、病理剖检 、血清学和病原学结果进行 。血清学阳性并不表明感染本病 。病原分离并鉴定是确诊本病的最重要根据 。

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　支原体培养基的制备

　　A. 1 10%马血清马丁肉汤(pH7. 8~8. 0)

　　将制备的马丁肉汤分装于灭菌试管内 ,每管 4. 5 mL,添加无菌马血清 0. 5 mL。

　　A.2 10%马血清马丁琼脂

　　马丁肉汤中加入琼脂 ,使含量达到 1. 3% ~ 1. 5% ,经 121kPa高压灭菌 30min即成马丁琼脂 。在灭菌的 6 cm~ 8 cm 直径培养皿内加无菌马血清 1 mL,再添加煮沸融化降温至 55 ℃ ~ 60 ℃的马丁琼脂9 mL,轻轻摇动混合均匀 ,静置凝固后即成马丁琼脂培养基 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　糖培养基管的制备

　　取蛋白胨水(pH7. 8~ 8. 0) 100 mL、氯化钠 0. 5 g、所 需 各 种 糖 类 0. 5 g~ 1. 0 g,溶 解 各 成 分 , 加 入1. 6%溴甲酚紫酒精溶液指示剂 0. 1 mL混匀 。分装到试管中 ,每管 2 mL,管内装有倒置的小玻璃管(杜汉氏发酵管) 。经 106. 4 kPa20 min灭菌备用 。

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　乙酸铅纸条的制备

　　取滤纸剪成 6. 5 cm×0. 6 cm 大小的纸条 ,置平皿中 ,经 112kPa20 min灭菌 ,烘干 。再将滤纸条浸泡在灭菌的饱和乙酸铅溶液(10 g 乙酸铅溶于 50 mL沸蒸馏水中 , 即为饱和乙酸铅溶液) ,浸透后取出 ,置无菌平皿内 ,37 ℃烘干 ,保存于灭菌的试管中备用 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　硝酸盐还原试验培养基和指示剂的配制

　　D. 1 硝酸盐还原试验培养基的配制

　　取营养肉汤 或 马 丁 肉 汤 100 mL, 硝 酸 钾 (KNO3 ) 0. 1 g,调 pH 至 7. 8~ 8. 0, 分 装 试 管 , 112 kPa 20 min灭菌备用 。

　　D.2 指示剂的配制

　　试剂 1: 甲液 :对氨基苯磺酸 0. 5 g,5 mol/L乙酸 ; 乙液 :α-萘胺 0. 5 g,5 mol/L乙酸 100 mL。

　　试剂 2:二苯胺试剂 :二苯胺 0. 5 g溶于 100 mL浓硫酸中 ,用 20 mL蒸馏水稀释 。

　　附 录 E

　　(规范性附录)

　　靛基质试验培养基和指示剂的配制

　　E. 1 靛基质试验培养基的配制

　　蛋白胨 1 g,氯化钠 0. 5 g,色氨酸 0. 1 g,蒸馏水 100 mL。溶解各成分 ,调 pH 至 7. 8~ 8. 0,分装试管 ,经 106. 4 kPa20 min灭菌备用 。

　　E.2 指示剂的配制

　　对二甲基氨基苯甲醛 5 g,95%乙醇 75mL,浓盐酸 25mL。将对二甲基氨基苯甲醛溶于乙醇中 ,再缓缓加入浓盐酸即成 。

　　附 录 F

　　(规范性附录)

　　甲基红(MR)试验培养基和指示剂的配制

　　F. 1 甲基红(MR)试验培养基的配制

　　蛋白胨 0. 7 g,葡萄糖 0. 5 g,磷酸氢二钾 0. 5 g,蒸馏水 100 mL。各成分溶解后 ,调 pH7. 8~ 8. 0,分装试管 。经 106. 4 kPa20 min灭菌备用 。

　　F.2 指示剂的配制

　　甲基红 0. 02 g,95%酒 精 60 mL, 蒸 馏 水 40 mL。 先 将 甲 基 红 研 磨 , 溶 解 于 酒 精 中 , 再 加 蒸 馏 水即成 。

　　附 录 G

　　(规范性附录)

　　维培二氏(V-P)试验培养基的配制

　　G. 1 Barritt’s试剂的配制

　　甲液 :6% α-萘酚酒精溶液 。 乙液 :40%氢氧化钾溶液 。

　　G.2 O’Meara’s试剂的配制

　　氢氧化钾(或氢氧化钠)40 g,肌酐(creatine) 0. 3 g,溶于蒸馏水 100 mL,经 106. 4 kPa20 min灭菌备用 。

　　G.3 硫酸铜的配制

　　1 g硫酸铜溶于 40 mL浓氨水中 ,加 10%氢氧化钾 960 mL 即成 。

　　附 录 H

　　(规范性附录)

　　巴比妥缓冲液(VB)配制

　　氯化钠 85 g

　　巴比妥酸 5. 75 g

　　巴比妥钠 3. 75 g

　　氯化镁(MgCl2 · 6H2 O) 1. 68 g

　　氯化钙(CaCl2 · 2H2 O) 0. 37 g

　　灭菌双蒸水 2 000 mL

　　用盐酸调节 pH 至 7. 3,使用时用灭菌双蒸水作 1 ∶ 5稀释 。

　　附 录 I

　　(规范性附录)

　　阿氏液配制

　　用 5%柠檬酸调节 B液 pH 至 6. 1。混合 A液 、B液 ,用蔡氏滤器过滤除菌 。

　　附 录 J

　　(规范性附录)

　　6%绵羊红细胞的制备

　　无菌采集健康公绵羊静脉血 ,脱纤后用阿氏液悬浮 , 1 500 g 洗涤 3 次 , 每次 10 min。 收集红细胞沉淀 ,用阿氏液配成 6%悬液 ,4 ℃放置 48h后使用 ,但最多使用不超过 3周 。

　　附 录 K

　　(规范性附录)溶血素效价测定

　　溶血素效价的测定 :取 0. 1 mL溶血素作 10倍系列稀释至 1 ∶ 1 000作为基础液 ,其稀释方法见表K. 1。

　　表 K. 1 单位为毫升

　　按照表 K. 2程序加入各种试验成分 ,在 37℃水浴 30min,1500g 离心 10min。将 100%溶血管的液体与等体积 VB混合制成 50%溶血比色管 。 能使红细胞液 50%溶血(HD50)的溶血素最大稀释度作为溶血素效价 ,使用 12个单位的 HD50 。

　　表 K.2 单位为毫升

　　如表 K.2 中第 8 管溶血程度达到 50% , 而空白对照管都没有溶血现象 ,则该批溶血素的效价即为1 ∶ 8000,使用 12个单位的 HD50,则应将溶血素作 8000/12=666. 6倍稀释 。

　　附 录 L (规范性附录)补体效价测定

　　使用 VB稀释补体 ,具体操作见表 L. 1 和表 L.2。

　　表 L. 1

　　表 L.2

　　将 1 ∶ 30~1 ∶ 110各稀释度补体 25μL加入 1. 5 mL离心管中 ,每个补体稀释度孔中加入 25 μLVB,再加入 25μL致敏后的绵羊红细胞 ,振荡混匀后 37 ℃水浴 30min后 125g 离心 2 min,判定结果 。

　　补体效价判定 :使绵羊红细胞 100%溶解的补体最高稀释度即是该补体效价 。检测时使用 2. 5 U 补

　　释。例。如补体在 1 ∶ 60时使绵羊红细胞 100%溶解 ,那么该补体效价为 60,使用时应作 60/2. 5= 24倍

　　附 录 M (规范性附录)抗原效价测定

　　M. 1 用 VB液 2倍连续稀释抗原 ,从 1 ∶ 10到 1 ∶ 640。

　　M.2 用 VB液 2倍连续稀释阳性血清 ,从 1 ∶ 10到 1 ∶ 1280。

　　M.3 使用 96孔微量反应板对抗原进行方阵滴定 。具体操作如图 M. 1。每孔分别加入对应稀释度的抗原25μL、阳性血清 25μL、2. 5 U补体 25μL,振荡混匀后 37 ℃水浴 30 min。每孔加入致敏后的绵羊红细胞25μL,振荡混匀后 37℃水浴 30min。125g 离心 2 min判定结果 。 同时设 0. 5 U、1 U、2. 5 U补体对照 ,致敏红细胞对照 ,每个抗原稀释度的抗补体对照 。

　　图 M. 1

　　M.4 当对照全部成立的情况下 ,补体 100%被结合的阳性血清最高稀释度对应的抗原最高稀释度即是抗原效价 。如图 M. 1所示 ,当阳性血清 1 ∶ 160、抗原 1 ∶ 80时 ,抗原抗体复合物能够结合 100%补体 ,那么该抗原效价为 1 ∶ 80。检测时使用 2个单位 ,将抗原作 80/2=40倍稀释 。

　　附 录 N

　　(规范性附录)

　　补体结合百分率判定

　　补体结合百分率判定见表 N. 1。

　　表 N. 1

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