GB/T 40980-2021 生化制品中还原糖的测定 柱前衍生高效液相色谱法

　　ICS 07 . 080 CCS A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40980—2021

　　生化制品中还原糖的测定柱前衍生高效液相色谱法

　　Determinationofreducingsugarinbiochemicalproducts—

　　High-performanceliquidchromatographywithpre-columnderivatization

　　2021-1 1-26 发布 2022-06-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40980—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。

　　本文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、深圳市分析测试协会、甘肃中商食品质量检验检测有限公司、西华大学、电子科技大学、青岛科技大学、中国测试技术研究院。

　　本文件主要起草人：刘明东、许洋、管驰、杨锐、陈鹏、黄玉坤、蒋子敬、周鑫魁、马丽侠、程玉华、钱滢文、吴微、杨杰、王力均、叶德萍、陈凯、张简、张永勤、洪霞、周李华。

　　GB/T 40980—202 1

　　生化制品中还原糖的测定柱前衍生高效液相色谱法

　　1 范围

　　本文件规定了采用柱前衍生高效液相色谱法测定生化制品中 D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、L-阿拉伯醛糖、D-木糖、L-岩藻糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-乳糖 10 种还原糖的测定方法。

　　本文件适用于含糖胃蛋白酶、静脉注射用人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、改良 Y 培养基、葡萄糖肉汤培养基、缓冲动力-硝酸盐、木糖-明胶培养基等生化制品中的甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖含量测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 原理

　　样品中的还原糖经沸水提取，提取液与 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)在碱性条件下反应，生成糖衍生物，经液相色谱分离紫外检测器测定，色谱保留时间定性、外标法定量。

　　5 试剂或材料

　　除特殊说明外，本方法所用试剂除流动相为色谱纯外均为分析纯，试验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。

　　5 . 1 磷酸二氢钾(KH 2 PO4) 。

　　5.2 氢氧化钠(NaOH)。

　　5 . 3 亚铁氰化钾 [ K4 Fe( CN) 6 ·3H 2 O] 。

　　5 . 4 乙酸锌[Zn( CH 3 COO) 2 ·2H 2 O] 。

　　5 . 5 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(C10 H 10 N2 O, PMP) 。

　　5 . 6 盐酸( HCl) 。

　　5 . 7 三氯甲烷(CHCl3) 。

　　5 . 8 甲醇(CH 3 OH) 。

　　5 . 9 乙腈(CH 3 CN) ：色谱纯。

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　　5 . 10 三乙胺(C6 H 15 N) 。

　　5 . 1 1 正己烷(C6 H 6) 。

　　5. 12 亚铁氰化钾溶液(106 g/L)：称取 106.0 g 亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至 1 000 mL。

　　5. 13 乙酸锌溶液(220 g/L)：称取 220.0 g 乙酸锌，用水稀释至 1 000 mL。

　　5. 14 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生溶液：称取 87.1 g PMP 衍生化试剂，加甲醇溶解并定容至 1 000 mL。

　　5. 15 1.0 mol/L NaOH 溶液：称取 40.0 g 氢氧化钠，加入水中溶解并稀释至 1 000 mL。

　　5. 16 1. 0 mol/L HCl 溶 液：取 83. 2 mL 浓 盐 酸，缓慢 加 入 约 800 mL 水 中，冷 却 后 加 水 定 容至1 000 mL。

　　5 . 17 糖标准品：D-甘露糖(CAS:3458-28-4)、D-核糖(CAS:50-69-1)、L-鼠李糖(CAS: 10030-85-0) 、D-半乳糖(CAS:59-23-4)、L-阿拉伯醛糖(CAS: 5328-37-0)、D-木糖(CAS:31178-70-8)、L-岩藻糖(CAS: 2438-80-4)、D-葡 萄 糖 ( CAS: 50-99-7) 、D-麦 芽 糖 ( CAS: 3458-28-4) 、D-乳 糖 ( CAS: 63-42-3) , 纯 度均 ≥99%。

　　5. 18 混合标准储备液：分别称取 100 mg标准物质(精确至 0.1 mg) ,用水溶解并定容至 100 mL,配制成质量浓度约为 1 000 μg/mL 的混合标准储备液，冷藏保存。

　　5. 19 标准工作溶液的配制：分别取 0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL混合标准储备液定容至 10 mL容量瓶，配制成 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 200 μg/mL标准溶液浓度系列。

　　5.20 微孔过滤膜：孔径 0.45 μm。

　　6 仪器设备

　　6 . 1 高效液相色谱仪：配紫外检测器(UV)或二极管阵列检测器(DAD) 。

　　6.2 分析天平：感量0.01 mg 和0.000 1 g。

　　6.3 超声波提取器：功率 250 W,工作频率 40 kHz。

　　6 . 4 离心机：最大转速15 000 r/ min。

　　6.5 酸度计：精度为 0.01 个 pH 单位，pH 值测定范围为 0~14。

　　6 .6 数显恒温水浴锅：精确度到 0 .1 ℃。

　　6 . 7 涡旋混匀器。

　　6 . 8 电动粉碎机。

　　7 分析步骤

　　7 . 1 样品制备

　　取有代表性的样品至少 50 g, 固体样品(液体样品混匀直接待用)用电动粉碎机粉碎(过孔径为0.3 mm 的筛)，混匀后装入洁净的盛样容器内，作为试样，室温密封储存。

　　7 . 2 样品前处理

　　7 . 2 . 1 固体样品前处理

　　称取样品 5 g(精确到 0.001 g)于 50 mL离心管中，加入 20 mL水，在沸水浴中提取 30 min,超声提取 10 min;样液泠却后，加入正己烷 5 mL,涡旋 2 min,于 5 000 r/min 离心 5 min,弃去正己烷层，将水层清液倒入 50 mL容量瓶中;向固体残渣中加入 10 mL水，涡旋 2 min,于 5 000 r/min 离心 3 min,水

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　　层合并于上述 50 mL容量瓶中，加入 5 mL亚铁氰化钾溶液，5 mL 乙酸锌溶液，用水定容，混匀，离心取上清液，经 0.45 m 滤膜过滤后待用。

　　7 . 2 . 2 含油脂及蛋白类液体样品前处理

　　称取样品 5 g(精确到 0.001 g)于 50 mL离心管中，加入 20 mL水，在沸水浴中提取 15 min,超声提取 10 min,样液冷却后，加入 3mL亚铁氰化钾溶液，3 mL 乙酸锌溶液，用水定容至 40 mL,充分振摇离心管，于 5 000 r/ min 离心 5 min;取部分澄清水层，加入正己烷 5 mL,振摇或涡旋 2 min,于 5 000 r/ min离心 5 min。取水层清液，经 0.45 μm 滤膜过滤后待用。

　　7 . 2 . 3 不含油脂及蛋白类液体样品前处理

　　称取样品 5 g(精确到 0.001 g)于 50 mL离心管中，加水至 40 mL,在沸水浴中提取 15 min,超声提取 10 min,样液泠却后，转移至 50 mL容量瓶中定容，取水层清液经 0.45 μm 滤膜过滤后待用。

　　7 . 3 试样衍生

　　分别吸取试样和不同浓度的标准工作溶液 0 .4 mL 于 15 mL 具塞试管中，加入 1 .0 mol/L NaOH溶液 0.2 mL, 0. 5 mol/L PMP 衍生溶液 1.0 mL,在 70 ℃恒温水浴中反应 60 min;冷却至室温，加入 1.0 mol/L HCl 溶液 0.2 mL,摇匀后，氮气吹干;加入 2 mL蒸馏水复溶，再加入 2 mL 三氯甲烷，充分涡旋后静置或离心，弃去下层有机层，重复此操作三次，取上层水相过 0.45 μm 滤膜后进入液相色谱分析。

　　7 . 4 仪器色谱参考条件

　　仪器色谱参考条件如下：

　　a) 色谱柱：C18色谱柱，250 mm×4.6 mm, 3.0 μm,或同等性能的色谱柱;

　　b) 流动相：A 相为含 20 mmol/L KH2 PO4(三乙胺调节 pH 值至 7.8±0.1)水溶液，B 相为乙腈，梯度条件见表 1 ;

　　c) 流量：1 . 0 mL/ min ;

　　d) 柱温：35 ℃ ;

　　e) 检测器波长：250 nm ;

　　f) 进样量：10 μL。

　　表 1 梯度洗脱参考条件

　　7 . 5 标准曲线的制作

　　以标准工作溶液中 目标还原糖的浓度为横坐标，以响应值为纵坐标，绘制标准工作曲线。

　　10 种还原糖标准品色谱图见附录 A 中图 A. 1 。

　　7 . 6 样品的测定

　　将待测样品液上机测定，记录色谱图，根据保留时间定性，记录峰面积，根据标准曲线计算待测样品

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　　液中糖的浓度。

　　8 分析结果计算与表示

　　试样中还原糖含量按照式(1)计算：

　　X …………………………( 1 )

　　式中：

　　X— 样品中还原糖的含量，单位为克每一百克(g/100 g) ;

　　ρ— 从标准工作曲线上得到的被测组分溶液质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL) ;

　　V— 样品溶液定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　K— 样品稀释倍数;

　　m— 所称试样的质量，单位为克(g)。

　　计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

　　9 精密度

　　在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　10 其他

　　本方法测定 10 种糖标准品的参考检出限和定量限见表 2 。

　　表 2 10 种糖标准品检出限和定量限

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　液相色谱图

　　还原糖衍生化标准品色谱图典型图见图 A. 1 。

　　标引序号说明：

　　1 — 甘露糖;

　　2 — 核糖;

　　3 — 鼠李糖;

　　4 — 乳糖;

　　5 — 麦芽糖;

　　6 — 葡萄糖;

　　7 — 半乳糖;

　　8 — 木糖;

　　9 — 阿拉伯糖;

　　10 — 岩藻糖。

　　图 A.1 10 种还原糖衍生物的出峰时间图