GB/T 40644-2021 杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测 高效液相色谱法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 CCS B 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40644—2021

　　杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测

　　高效液相色谱法

　　Determinationofgeniposidicacidinextractofeucommiaulmoidesoliverleaf—

　　HPLC

　　2021-10-1 1 发布 2022-05-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40644—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由国家林业和草原局提出。

　　本文件由全国林化产品标准化技术委员会(SAC/TC 558)归口 。

　　本文件起草单位：北京林业大学、中国标准化研究院、浙江圣氏生物科技有限公司、河北冠卓检测科技股份有限公司、深圳市品牌建设促进中心、中山洪力健康食品产业研究院、中国林业科学研究院林产化学工业研究所、南京林业大学、无限极(中国)有限公司。

　　本文件主要起草人：雷建都、席兴军、刘静、王璐莹、陈永健、张敬轩、沈晓昱、杨志花、郑萍、王成章、黄超伯、兰韬、李文君、杨中志、孙红梅。

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　　杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测

　　高效液相色谱法

　　1 范围

　　本文件描述了用高效液相色谱测定杜仲叶提取物中京尼平苷酸含量的原理、试剂与材料、仪器与设备、测定步骤、结果计算与表示、重复性、精密度和加标回收率。

　　本文件适用于杜仲叶提取物中京尼平苷酸含量的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 原理

　　在同一个分析周期中，按一定时间程序调节流动相配比，使杜仲叶提取物中关键组分按各自适宜的容量因子达到良好的分离目的。

　　采用京尼平苷酸对应的标准物质外标法直接定量，采用的色谱柱为反相 C18 柱 。

　　注：京尼平苷酸又称为京尼平甙酸、栀子苷酸或栀子甙酸，是一种环烯醚萜葡萄糖苷。

　　京尼平苷酸紫外光谱测定表明其最大紫外吸收波长为 240 nm, 因此确定 240 nm 作为京尼平苷酸的高效液相色谱检测波长。

　　5 试剂与材料

　　除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合 GB/T 6682 一级的水。

　　5 . 1 试剂

　　5 . 1 . 1 甲醇(CH 3 OH),色谱纯 。

　　5. 1 .2 磷酸(H3 PO4) ,含量 85%。

　　5 . 2 标准品

　　京尼平苷酸标准品：纯度 ≥98%。

　　5 . 3 京尼平苷酸标准储备溶液

　　称取 200 mg(精确至 0 . 001 g)京尼平苷酸标准品，置于 100 mL容量瓶中，用甲醇使其溶解并定容

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　　至刻度线，混匀。

　　5 . 4 京尼平苷酸标准工作溶液

　　将京尼平苷酸标准储备溶液用甲醇稀释制备一系列标准溶液，标准液浓度分别为 0 . 01 mg/mL、

　　0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL、0.60 mg/mL、1.2 mg/mL, 临用时配制。

　　5 . 5 材料

　　滤膜，孔径 0 . 45 μm 有机相滤膜。

　　6 仪器与设备

　　6 . 1 分析天平：灵敏度万分之一克。

　　6 . 2 高效液相色谱仪：包含梯度洗脱系统、紫外检测器及色谱工作站。

　　6.3 超声波清洗仪：超声频率 40 kHz~80 kHz。

　　7 检测方法

　　7 . 1 样品处理

　　称取杜仲叶提取物样品 0 . 050 g(精确至 0 . 001 g),置于烧杯中，加适量甲醇超声溶解，然后转移至50 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，用 0 . 45 μm 有机相滤膜微滤，然后进样入 HPLC分析。

　　7 . 2 测定条件

　　按照制造商操作手册运行高效液相色谱仪。 以下分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适用性。

　　色谱条件如下：

　　— 色谱柱：RP-C18[250 mm×4.6 mm(内径)，5 μm] ;

　　— 流速：1.0 mL/min;

　　— 柱温：30 ℃ ;

　　— 进样量：10 μL;

　　— 检测波长：240 nm;

　　— 流动相：A. 甲醇;B. 0 . 1%磷酸水溶液。

　　采用梯度洗脱，梯度洗脱条件见表 1 。

　　表 1 HPLC梯度洗脱条件

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　　7 . 3 标准曲线绘制

　　按 7.2 色谱条件检测，分别吸取 10 μL标准品标准工作溶液注入高效液相色谱仪，以色谱峰的峰面积为纵坐标，对应的工作溶液标准品浓度为横坐标，进行线性回归分析得到标准曲线方程。

　　京尼平苷酸标准品的 HPLC色谱图参见附录 A。

　　7 . 4 试样测定

　　按 7 . 2 的色谱条件，取 7 . 1 步骤中的滤液进样，得到试样溶液的峰面积，根据保留时间和京尼平苷酸标准品色谱图定性。 根据标准曲线计算试样溶液中京尼平苷酸的含量。

　　试样溶液中京尼平苷酸的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应将试样溶液稀释后测定或增加提取物的质量重新检测。

　　8 结果计算与表示

　　8 . 1 结果计算

　　杜仲叶提取物中京尼平苷酸含量按式(1)进行计算：

　　X …………………………………( 1 )

　　式中：

　　X —样品中京尼平苷酸的含量，单位为毫克每克(mg/g) ;

　　c —样品中京尼平苷酸的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　V —最终定容后样品的体积，单位为毫升(mL) ;

　　m —试样的质量，单位为克(g)。

　　8 . 2 结果表示

　　计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留至小数点后两位有效数字。

　　9 重复性

　　在重复条件下获得的 5 次独立测定结果的相对标准偏差小于 5%。

　　10 精密度

　　取同一试样，连续进样 5 次，按 7 . 2 的色谱条件检测其 HPLC 图谱;比较京尼平苷酸对应色谱峰的峰面积，5 次进样的峰面积的相对标准偏差(RSD)不超过 5%。

　　1 1 加标回收率

　　标准品添加量在待测样品浓度 0 . 5~1 . 5 倍浓度范围内，回收率在 90%~110%之间，相对标准偏差

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　色谱图示例

　　京尼平苷酸标准样品及提取液色谱图示例见图 A. 1 和图 A. 2 。其中，峰 1 为京尼平苷酸。

　　图 A.1 京尼平苷酸标准品的色谱图

　　图 A.2 杜仲叶提取物的色谱图