GB/T 40183-2021 DNA甲基化的测定 焦磷酸测序法

　　ICS 07 . 080 A 2 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40183—2021

　　DNA 甲基化的测定 焦磷酸测序法

　　DeterminationofDNA methylation—pyrosequencing

　　2021-05-21 发布 2021-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40183—202 1

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由中国标准化研究院提出并归口 。

　　本标准起草单位：河北医科大学、中国标准化研究院、河北省食品检验研究院、中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心、河北师范大学。

　　本标准主要起草人：吕品、马爱进、张岩、林浩、李永鹏、李东明、黄芸、杨宏超。

　　GB/T 40183—202 1

　　DNA 甲基化的测定 焦磷酸测序法

　　1 范围

　　本标准规定了用焦磷酸测序法测定 DNA 甲基化的方法。

　　本标准适用于动植物组织或体外培养细胞 DNA 甲基化测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义、缩略语

　　3 . 1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3 . 1 . 1

　　DNA 甲基化 DNA methylation

　　在 DNA 甲基转移酶的催化下，以 S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移至碱基特定结构上的过程。

　　3 . 2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　4 原理

　　DNA 经重硫酸盐硫化处理后，DNA 双链中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，通过 PCR 将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶，根据 PCR产物中相应甲基化位点的胞嘧啶和胸腺嘧啶的比例进行定量。

　　5 试剂或材料

　　除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

　　5 . 1 水：GB/T 6682,二级水 。

　　5 . 2 动物基因组 DNA 提取试剂盒。

　　5 . 3 植物基因组 DNA 提取试剂盒。

　　5.4 20 pmol/μL焦磷酸测序用引物。

　　5 . 5 PCR试剂盒。

　　GB/T 40183—202 1

　　5 . 6 DNA 重亚硫酸盐快速转化试剂盒。

　　5 . 7 焦磷酸测序试剂盒。

　　5.8 70%(体积分数)乙醇。取 70 mL无水乙醇加水稀释定容至 100 mL。

　　5.9 溴化乙锭溶液。称取 1 g 溴化乙锭加水稀释定容至 100 mL,磁力搅拌至完全溶解，然后将溶液保存于棕色瓶中，室温保存。

　　5. 10 50 × 电泳缓冲液。称取 242 g Tris 溶于 800 mL 蒸馏水中，加入 57. 1 mL 冰乙酸和 100 mL

　　0.5 mol/L 乙二胺四乙酸溶液(pH 8.0),再加蒸馏水定容至 1 000 mL,室温保存，稀释 50 倍使用。

　　5. 1 1 2%(质量分数)琼脂糖凝胶。称取 2 g琼脂糖置于烧瓶中，加入 100 mL 电泳缓冲液，加热使琼脂糖充分溶解，适当冷却，然后加入 7 μL溴化乙锭溶液，混匀，将其缓慢地倒入放有梳子的制胶槽中，室温放置待琼脂糖凝固后拔下梳子，取出凝胶，4 ℃密封保存备用。

　　5. 12 6 × 电泳加样缓冲液。称取 0.25 g 溴酚蓝、40 g 蔗糖置于 100 mL烧杯中，加蒸馏水至完全溶解后定容至 100 mL。

　　5. 13 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸溶液。称取 18.61 g 乙二胺四乙酸二钠二水合物，加入 80 mL 水，充分搅拌，用氢氧化钠调 pH 至 8.0,然后定容至 100 mL。

　　5. 14 标准相对分子质量 DNA(100 bp~2 000 bp)。

　　6 仪器设备

　　6. 1 分析天平：感量 0.001 g。

　　6 . 2 离心管：1 . 5 mL 和 2 mL。

　　6 . 3 PCR仪 。

　　6 . 4 水平电泳槽。

　　6 . 5 电泳仪。

　　6.6 低温离心机：最大离心力 25 910g。

　　6 . 7 凝胶成像系统。

　　6 . 8 核酸检测仪。

　　6 . 9 焦磷酸测序仪。

　　6 . 10 PCR 管 。

　　7 测定步骤

　　7 . 1 DNA提取

　　按照动物或植物基因组 DNA 提取试剂盒说明进行提取。

　　7 . 2 DNA重亚硫酸盐转化

　　按照 DNA 重亚硫酸盐快速转化试剂盒说明进行操作。

　　7 .3 甲基化 PCR扩增目的片段

　　7 . 3 . 1 PCR反应体系

　　配制 50 μL PCR反应体系：以 10 ng~20 ng 重亚硫酸盐转化后的 DNA 溶液为模板，按照 PCR 试剂盒说明加入试剂，再加入焦磷酸测序引物对中的上下游引物各 0.5 μL,用水补足体积至 50 μL。在

　　PCR仪上扩增。

　　GB/T 40183—202 1

　　7 . 3 . 2 PCR扩增产物电泳检测

　　在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过琼脂糖凝胶;将 3 μL~6 μL PCR扩增产物分别和适量 6×电泳加样缓冲液混合，点样;以标准相对分子质量 DNA做对照;9 V/cm 恒压电泳，直至溴酚蓝指

　　示剂迁移至凝胶中部;用凝胶成像系统观察电泳结果并记录;电泳检测合格的 PCR产物用于测序。

　　7 . 4 焦磷酸测序

　　利用焦磷酸测序仪及焦磷酸测序试剂盒进行以下操作：在焦磷酸测序仪配套软件中生成运行程序，

　　加载运行前试剂耗材和程序，将上样圆盘放入机器，按程序在相应的孔位加入 10 μL 含生物素标记的PCR产物和 3 μL焦磷酸测序测序仪配套的磁珠，运行焦磷酸测序仪程序，导出结果。

　　8 结果分析

　　使用焦磷酸测序仪将运行后的数据拷贝到电脑中，打开软件并载入运行后的文件，选择 CpG 模式，

　　对每个样本的焦磷酸测序结果进行分析，结果中所测位点处显示的百分数即为该位点甲基化的比例。