GB/T 40049-2021 鸡肠炎沙门氏菌PCR检测方法

　　ICS 1 1 . 220 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40049—2021

　　鸡肠炎沙门氏菌 PCR检测方法

　　PCR detectionmethodofchickensalmonellaenteritis

　　2021-04-30 发布 2021-1 1-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40049—202 1

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

　　本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SC/TC 181)归口 。

　　本标准起草单位：山东农业大学、青岛农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、山东省农业科学院家禽研究所、秦皇岛海关、山东派克检测技术有限公司。

　　本标准主要起草人：常维山、孙淑红、王述柏、翟海华、崔言顺、柴同杰、鞠孜敬、赵效南、王涛、黄兵、宋敏训、马秀丽、高月花、郑德云、郭树源、马洪超、孙杰、张富友。

　　GB/T 40049—202 1

　　鸡肠炎沙门氏菌 PCR检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了鸡肠炎沙门氏菌分子分型的 PCR 检测方法。

　　本标准适用于各种 日龄的鸡及其产品中携带的肠炎沙门氏菌的 PCR方法检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB 4789 . 4—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验

　　GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 28642—2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应(PCR)法

　　NY/T 541—2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　持家基因 house-keepinggene

　　生物体在生理、病理和不同发育阶段的在所有类型的细胞中都表达的一类基因。 这类基因高度保守，基因产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　5 试剂和材料

　　除另有规定外，所用试剂均为分析纯。 实验用水均符合 GB/T 6682—2008 二级水规定。

　　5 . 1 LB液体培养基(配制方法见附录 A 中 A. 1) 。

　　5 . 2 缓冲蛋白陈水(BPW)前增菌液(配制方法见 A. 2) 。

　　5 . 3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液(配制方法见 A. 3) 。

　　5 . 4 四硫磺酸盐煌绿(TTB)增菌液(配制方法见 A. 4) 。

　　5 . 5 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂 D. 3(配制方法见 A. 5) 。

　　5 . 6 TAE 电泳缓冲液(配制方法见 A. 6) 。

　　5 . 7 阳性、阴性对照：阳性对照为肠炎沙门氏菌标准株(CVCC3377) 培养液、鸡白痢沙门氏菌标准株

　　GB/T 40049—202 1

　　(CVCC535)培养液;阴性对照为灭菌超纯水。

　　5 . 8 细菌基因组 DNA 提取试剂盒：商品化试剂盒。

　　5 . 9 无水乙醇：-20 ℃预冷。

　　5 . 10 75% 乙醇：无水乙醇和双蒸水配制，-20 ℃预冷。

　　5. 1 1 DNA分子量标记：DNA Marker 2 000。

　　5 . 12 琼脂糖。

　　5 . 13 七个持家基因片段的 PCR 引物序列：参见附录 B 的 B. 1 。

　　5 . 14 2 × PCR Mix。

　　6 仪器

　　6 . 1 恒温培养箱(温度范围：5 ℃ ~ 50 ℃ ,温度均匀度：≤ ± 1 ℃ ) 。

　　6.2 高压灭菌锅(灭菌温度：105 ℃ ~ 135 ℃ ,工作压力：≤ 0.35 MPa)。

　　6.3 电子天平(感量 0.001 g)。

　　6 . 4 高速离心机(可控温至 4 ℃、离心速度可达 12 000 r/ min 以上)。

　　6 . 5 二级生物安全柜。

　　6.6 4 ℃冰箱(温控范围 2 ℃ ~ 8 ℃); -20℃冰箱。

　　6 . 7 PCR仪 。

　　6.8 电泳仪(电压 90 V ~ 120 V)。

　　6.9 微量移液器(2 μL、20 μL、200 μL、1 000 μL)及配套吸头。

　　6. 10 电泳仪(电压 90 V ~ 120 V)。

　　6. 1 1 控温摇床(温度范围：5 ℃ ~ 50 ℃, 振荡频率：30 r/min ~ 300 r/min)。

　　6 . 12 凝胶成像仪。

　　6 . 13 PCR反应管。

　　6. 14 1.5 mL带盖离心管。

　　7 沙门氏菌分离鉴定

　　7 . 1 样品采集、储存和运输

　　7 . 1 . 1 组织样品

　　选择具有典型临床症状的病死鸡，无菌取其肝脏、脾脏等组织样品，放置于无菌容器内，标记好组织名称和采样日期，冷藏运送到实验窒进行检测。 按照 NY/T 541—2016 中 6 . 2 执行。

　　7 . 1 . 2 肠内容物样品

　　按照 NY/T 541—2016 中 6 . 7 . 2 执行。

　　7 . 1 . 3 粪便样品

　　按照 NY/T 541—2016 中 6 . 8 . 1 执行。

　　7 . 1 . 4 泄殖腔拭子样品

　　按照 NY/T 541—2016 中 6 . 8 . 2 执行。

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　　7 . 2 沙门氏菌分离鉴定

　　按照 GB 4789 . 4—2016 执行，进行分离、培养，至生化试验部分，完成疑似沙门氏菌菌株的初步鉴定。

　　8 鸡肠炎沙门氏菌的 PCR检测方法

　　8 . 1 细菌基因组 DNA 提取

　　将初步鉴定为沙门氏菌的菌株用商品化试剂盒进行基因组 DNA 提取。 提取方法按试剂盒说明书要求进行。

　　8 . 2 持家基因引物

　　设计合成七个持家基因的引物。 引物 DNA 序列参见 B. 1 。

　　8 . 3 持家基因 PCR 扩增

　　用 B. 1 中所列七对引物对样品基因组 DNA 的七个持家基因分别进行 PCR 扩增。 具体实验操作符合 GB/T 28642—2012 检测技术要求。

　　50 μL PCR 反应体系参见 B.2。

　　PCR 反应程序：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 共 35 个循环;72 ℃ 7 min; 4 ℃

　　保存。

　　8 . 4 PCR产物电泳

　　取 5 μL~ 10 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳(电泳方法参见 GB/T 28642—2012),电泳结束

　　后，用凝胶成像仪观察结果。

　　8 . 5 PCR 阳性产物测序

　　将七个持家基因均扩增出特异性条带的 PCR 产物进行测序。

　　8 . 6 结果判定

　　8 . 6 . 1 试验成立条件

　　利用 B. 1 规定的七对引物，阳性对照菌株 PCR 产物电泳后分别出现七条特异性的扩增条带，阴性对照 PCR 产物无扩增条带，试验结果成立。 否则试验不成立。 七个持家基因的 PCR 产物电泳图参见附录 C。

　　8 . 6 . 2 肠炎沙门氏菌分子分型判定

　　使用 DNA 序列分析软件，将七个持家基因 PCR 产物 DNA 序列与附录 D 所列参考序列分别进行一对一比对(部分基因提供了 2 个 ~3 个参考序列)。

　　8 . 6 . 3 测序结果判定

　　七个基因的测序结果与附录 D 中所对应的参考序列(或之一)均完全一致(即：所测 aroc基因序列与 D. 1 . 1 或 D. 1 . 2 中序列之一完全一致、所测 dnaN 基因序列与 D. 2 . 1 或 D. 2 . 2 中序列之一完全一致、所测 hemD 基因序列与 D. 3 中序列完全一致、所测 hisD 基因序列与 D. 4 . 1 或 D. 4 . 2 中序列之一完全

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　　一致、所测 pUrE 基因序列与 D. 5 . 1 或 D. 5 . 2 中序列之一完全一致、所测 SUCA 基因序列与 D. 6 . 1 或D. 6 . 2 中序列之一完全一致、所测 thrA 基因序列与 D. 7 . 1 或 D. 7 . 2 或 D. 7 . 3 中序列之一完全一致)，则可判定样品为肠炎沙门氏菌阳性。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　培养基配制

　　A.1 LB液体培养基

　　A.1 . 1 成分

　　胰蛋白陈 5 g

　　酵母提取粉 10 g

　　氯化钠 10 g

　　水 1 000 mL

　　A.1 . 2 制备

　　将各成分加入水中，搅混均匀，121 ℃ ± 2 ℃ 高压灭菌 15 min,冷却后备用。

　　A.2 BPW前增菌液

　　A.2 . 1 成分

　　蛋白陈 10 . 0 g

　　氯化钠 5 . 0 g

　　磷酸氢二钠(含 12 个 结晶水) 9 . 0 g

　　磷酸二氢钾 1 . 5 g

　　水 1 000 mL

　　A.2 . 2 制备

　　将各成分加热溶解于 1 000 mL 水中，121 ℃ ± 2 ℃高压灭菌 15 min,冷却后备用。

　　A.3 sC增菌液

　　A.3 . 1 成分

　　蛋白陈 5 . 0 g

　　乳糖 4 . 0 g

　　亚硒酸氢钠 4 . 0 g

　　磷酸氢二钠 10 . 0 g

　　L-胱氨酸 0.01 g

　　水 1 000 mL

　　A.3 . 2 制备

　　将各成分加热溶解于 1 000 mL蒸馏水中，无菌操作分装于灭菌三角瓶或试管中备用。 当天制备当天使用，无需高压灭菌。

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　　A.4 TTB增菌液

　　A.4 . 1 成分

　　蛋白陈 9 . 0 g

　　牛肉粉 4 . 5 g

　　氯化钠 2 . 7 g

　　碳酸钙 40 . 5 g

　　胆盐 5 . 0 g

　　硫代硫酸钠 50 . 0 g

　　水 1 050 mL

　　A.4 . 2 制备

　　将各成分溶解于 1 050 mL蒸馏水中，加热煮沸，临用前加入 20% 碘液 20 mL, 0 . 1% 煌绿 10 mL,现配现用。

　　A.5 XLD鉴别培养基

　　A.5 . 1 成分

　　A.5 . 2 制备

　　将上述成分加热溶解于 1 000 mL 蒸馏水中，冷至 50 ℃左右时，倾入无菌平皿，备用。

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　　A.6 . 2 1 ×TAE 电泳缓冲液制备

　　先按 A. 6 . 1 所示成分配制 50 × TAE 电泳缓冲液，将其用蒸馏水 50 倍稀释即为工作浓度。

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　测序引物与反应体系

　　B.1 七个持家基因测序引物见表 B. 1 。

　　表 B.1 七个持家基因片段 PCR引物序列

　　B.2 PCR 反应体系见表 B. 2 。

　　表 B.2 PCR扩增反应体系

　　GB/T 40049—202 1

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　七个持家基因 PCR电泳图

　　肠炎沙门氏菌阳性菌株七个持家基因 PCR 电泳图见图 C. 1 。

　　说明：

　　1 —thrA;

　　2 —SUCA;

　　3 —pUrE;

　　4 —hemD;

　　5 —hiSD;

　　6 —dnaN;

　　7 —aroc;

　　M—DNA Marker Trans 2K。

　　图 C.1 阳性对照菌的七个持家基因 PCR扩增结果电泳图

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　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　七个持家基因 DNA 序列

　　D.1 aroc 基因

　　D.1 . 1 aroc5 /aroc454

　　D.1 . 2 aroc41

　　D.2 dnaN 基因

　　D.2 . 1 dnaN 2 /dnaN 494

　　GB/T 40049—202 1

　　D.2 . 2 dnaN 67

　　D.3 hemD 基因

　　D.4 hisD 基因

　　D.4 . 1 hisD 7/966

　　GB/T 40049—202 1

　　D.4 . 2 hisD 14

　　D.5 purE 基因

　　D.5 . 1 purE5

　　D.5.2 purE6

　　GB/T 40049—202 1

　　D.6 SUCA 基因

　　D.6 . 1 SUCA6

　　D.6 . 2 SUCA 192

　　D.7 thrA 基因

　　D.7 . 1 thrA 1

　　GB/T 40049—202 1

　　D.7 . 2 thrA 10

　　D.7 . 3 thrA 1 1