GB/T 28630.4-2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第4部分：组织病理学诊断法

　　ICS 65. 020. 30 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28630.4—2012

　　白斑综合征(WSD) 诊断规程

　　第 4 部分 :组织病理学诊断法

　　Diagnosticprotocolsforwhitespotdisease—

　　Part4: Histopathology method

　　2012-07-31发布 2012-11-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28630.4—2012

　　前 言

　　GB/T 28630《白斑综合征(WSD)诊断规程》分为五个部分 :

　　— 第 1部分 :核酸探针斑点杂交检测法 ;

　　— 第 2部分 :套式 PCR检测法 ;

　　— 第 3部分 :原位杂交检测法 ;

　　— 第 4部分 :组织病理学诊断法 ;

　　— 第 5部分 :新鲜组织的 T-E染色法 。

　　本部分为 GB/T 28630的第 4部分 。

　　本部分按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草 。

　　本部分由中华人民共和国农业部提出 。

　　本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归 口 。

　　本部分起草单位 : 中国水产科学研究院黄海水产研究所 、农业部全国水产技术推广总站 。

　　本部分主要起草人 :黄倢 、杨冰 、陈爱平 、宋晓玲 、史成银 、杨丛海 、魏琦 、刘莉 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28630.4—2012

　　白斑综合征(WSD)诊断规程

　　第 4 部分 :组织病理学诊断法

　　1 范围

　　GB/T 28630的本部分规定了白斑综合征组织病理学诊断法所需试剂与材料 、仪器设备 、操作步骤和结果判定 。

　　本部分适用于对发病的对虾或其他敏感宿主的确诊和对怀疑染病宿主的诊断 。

　　本部分不适用于对潜伏性感染或病毒的非感染性携带的标本进行病毒检测 。

　　2 原理

　　2. 1 白斑综合征的病原和病理学特征

　　白斑综合征(white spotsyndrome)又称白斑病(white spotdisease) 、白斑综合症 、对虾暴发性流行病 。 白斑综合征具有发病急和死亡率高的特征 ,其症状是发病对虾停止摄食 ,反应迟钝 ,或卧于池边或在水面浮游 ,某些濒死对虾在甲壳上出现白色的斑块 ,有时伴随对虾腹节微微变红 。

　　白斑综合征的病原 是 白 斑 综 合 征 病 毒(white spot syndrome virus, WSSV) 或 称 白 斑 病 毒(white spotvirus,WSV) ,它是一种双链 DNA(dsDNA) 病毒 , 能对大多数养殖对虾造成有致命的感染 。病毒粒子为长椭圆形 ,具有囊膜和独特的尾状物 ,直径 120nm~ 150nm ,长 270nm~ 290nm ,其基因组大小约 300 kb。病毒在细胞核内复制 ,不形成封闭体(occlusion body) 。

　　濒死虾在全身外胚层和中胚层起源的组织中呈现出病灶 ,病毒主要感染的组织包括甲壳下上皮(包括体表和附肢的甲壳下表皮 、胃上皮和后肠上皮) 、造血组织 、鳃 、结缔组织 、触角腺 、血细胞和淋巴器官等 。感染早期在核内形成的包涵体(inclusion) 呈嗜酸性 , 随着病毒的快速复制 ,造成核内染色质边移 ,细胞核肥大 ,包涵体的嗜碱性也越来越强 。

　　2. 2 技术原理

　　苏木精-伊红(H-E)染色在组织学和病理学中是一种常规染色方法 。通过染色液— 苏木精-伊红与组织细胞的不同组分分别相结合 ,使细胞核 、细胞质和细胞内其他结构产生反差明显的蓝紫色和红色 ,而可清晰地观察到各种不同的组织结构病理变化 。

　　3 试剂和材料

　　3. 1 除非另有说明 ,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。

　　3. 2 石蜡(熔点 52℃ ~ 54℃) :切片级 。

　　3. 3 二甲苯 。

　　3. 4 无水乙醇 。

　　3. 5 95%乙醇 。

　　3. 6 过滤海水 :盐度为 20~ 30的海水在室内放置 1周后 ,经滤纸和 0. 22μm 滤膜过滤 。

　　3. 7 戴维森氏 AFA(Davidson’sAFA)固定液 :见附录 A 的规定 。

　　1

　　GB/T 28630.4—2012

　　3. 8 迈尔-班尼特苏木精(Mayer-Bennett Hematoxylin)染色液 :见附录 A 的规定 。

　　3. 9 伊红-焰红染色液 :见附录 A 的规定 。

　　3. 10 粘片剂 :见附录 A 的规定 。

　　3. 11 85%乙醇 :见附录 A 的规定 。

　　3. 12 80%乙醇 :见附录 A 的规定 。

　　3. 13 75%乙醇 :见附录 A 的规定 。

　　3. 14 50%乙醇 :见附录 A 的规定 。

　　3. 15 阳性对照为受 WSSV感染且显示明显病理变化的对虾组织切片(苏木精-伊红染色) 。

　　3. 16 阴性对照为未受 WSSV感染的正常的对虾组织切片(苏木精-伊红染色) 。

　　4 仪器设备

　　4. 1 石蜡切片机 :满足 4μm~ 7μm厚度的石蜡连续切片要求 。

　　4. 2 程控组织脱水机或使用手工脱水步骤 。

　　4. 3 石蜡包埋机或使用手工包埋步骤 :满足石蜡切片机对石蜡块规格的要求 。

　　4. 4 程控切片染色机或使用手工染色步骤 。

　　4. 5 展片水浴锅 : 敞 口 ,无盖水浴锅或使用自制保温盒加一定温度的水代替 。

　　4. 6 平板烘片机 :室温至 100℃或使用恒温箱代替 。

　　4. 7 显微镜 :带高倍镜(40×)和油镜(100×) 。

　　4. 8 毛笔 。

　　4. 9 小镊子 。

　　4. 10 载玻片 。

　　4. 11 盖玻片 。

　　4. 12 玻片架 。

　　5 操作步骤

　　5. 1 样品准备

　　5. 1. 1 样品采集的要求和固定方法见附录 B 的规定 。

　　5. 1. 2 在制作切片前 ,按照附录 B 的方法进行取材修整 ,应保证标本的胃和鳃能被有效地切片 。

　　5. 2 脱水

　　75%乙醇(105 min) →85%乙醇(105 min) → 85%乙醇(105 min) → 95%乙醇(45 min) → 95%乙醇(45 min) → 无水乙醇(45 min) → 无水乙醇(45 min) 。

　　5. 3 透明

　　无水乙醇-二甲苯(1 ∶ 1,25 min) → 二甲苯(20 min) → 二甲苯(20 min) 。

　　5. 4 浸蜡

　　纯石蜡(80 min) → 纯石蜡(80 min) 。

　　5. 5 包埋

　　用石蜡包埋机进行包埋 。

　　2

　　GB/T 28630.4—2012

　　5. 6 切片

　　用石蜡切片机切片 ,厚度 5 μm。对每个石蜡包埋块至少切取两块不连续的切片 。

　　5. 7 展片

　　展片水浴锅(40℃)中展片 ,用涂有一层粘片剂的载玻片捞出 ,置于平板烘片机上于 45℃烘片 2 h。

　　5. 8 染色

　　二甲苯(5 min) → 二甲 苯(5 min) → 无 水 乙 醇(2 min) → 无 水 乙 醇(2 min) → 95%乙 醇(2 min) → 95%乙醇(2 min) → 80%乙醇(2 min) → 80%乙醇(2 min) → 50%乙醇(2 min) → 蒸馏水(2 min) → 蒸馏水(2 min) → 蒸馏水(2 min) → 迈尔-班尼特苏木精染色液(5 min) → 缓慢流动的 自来水(6 min) → 伊红-焰红染色液(2 min) → 95%乙醇(80 s) → 95%乙醇(2 min) → 无水乙醇(2 min) → 无水乙醇(2 min) → 二甲苯(150 s) → 二甲苯(150 s) → 二甲苯(150 s) 。

　　5. 9 封片

　　滴加 2滴中性树胶封片 。

　　5. 10 观察

　　明视野显微镜下观察 。

　　6 结果判定

　　6. 1 正常样品的组织切片经 H-E染色后 ,核质反差明显 ,细胞质染成红色 ,细胞核染成蓝紫色 。

　　6. 2 白斑综合征的病灶主要出现在对虾的甲壳下上皮(包括体表和附肢的甲壳下表皮 、胃上皮和后肠上皮) 、造血组织 、结缔组织 、鳃 、触角腺 、血细胞 、淋巴器官等组织中 ,最方便观察的组织是覆盖有甲壳质的胃上皮 。在肝胰腺管上皮 、中肠上皮和肌肉细胞中无感染病灶 ,但在这些组织中的结缔组织和血细胞中可见到病灶 。

　　6. 3 受感染的细胞 ,其细胞核的核仁消失 ,早期感染在核内出现嗜酸性着色(显红色) , 晚期感染的细胞核肿大 ,染色质边移 ,核内呈不同程度地较均匀的嗜碱性着色(紫色) 。核内嗜酸性着色(显红色) ,较深且均一 。

　　6. 4 诊断结果可疑时 ,补充核酸探针的原位杂交检测或 PCR检测进行确诊 。

　　3

　　GB/T 28630.4—2012

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　试 剂 配 方

　　A. 1 85%乙醇

　　95%乙醇 850 mL

　　加水定容至 950 mL

　　混匀 ,室温贮存 。

　　A. 2 80%乙醇

　　95%乙醇 800 mL

　　加水定容至 950 mL

　　混匀 ,室温贮存 。

　　A. 3 75%乙醇

　　95%乙醇 750 mL

　　加水定容至 950 mL

　　混匀 ,室温贮存 。

　　A. 4 70%乙醇

　　95%乙醇 700 mL

　　加水定容至 950 mL

　　混匀 ,室温贮存 。

　　A. 5 50%乙醇

　　95%乙醇 500 mL

　　加水定容至 950 mL

　　混匀 ,室温贮存 。

　　A. 6 戴维森氏 AFA(Davidson’sAFA)固定液

　　95%乙醇

　　330 mL

　　甲醛(37%)

　　220 mL

　　冰乙酸

　　115 mL

　　海水(用于海洋甲壳类)或自来水混匀 ,室温密封贮存 。

　　335 mL

　　4

　　GB/T 28630.4—2012

　　A. 7 R-F 固定液

　　95%乙醇

　　407

　　mL

　　甲醛(37%)

　　349

　　mL

　　海水(用于海洋甲壳类)或自来水

　　222

　　mL

　　混匀 ,加入氨水(含 28% ~ 30% NH3 )约 22 mL,将 pH 调整到 6.0~ 7.0。室温密封贮存 。

　　A. 8 迈尔-班尼特苏木精染色液

　　热水

　　1 000 mL

　　苏木素

　　1.0 g

　　碘酸钠

　　0.2 g

　　钾明矾

　　90.0 g

　　柠檬酸

　　1.0 g

　　水合三氯乙醛

　　50.0 g

　　按上述顺序混合 ,溶解后即可使用 ,室温贮存 。

　　A. 9 1%伊红贮存液

　　伊红 Y(水溶性) 5 g

　　水 500 mL

　　溶解后置于棕色瓶中 ,室温贮存 。

　　A. 10 1%焰红贮存液

　　焰红 B(水溶性) 1 g

　　水 100 mL

　　溶解后置于棕色瓶中 ,室温贮存 。

　　A. 11 伊红-焰红染色液

　　1%伊红贮存液

　　100 mL

　　1%焰红贮存液

　　10 mL

　　95%乙醇

　　780 mL

　　冰乙酸

　　4 mL

　　混匀后即可使用 ,室温贮存 。

　　A. 12 粘片剂

　　明胶

　　1 g

　　热水

　　100

　　mL

　　5

　　GB/T 28630.4—2012

　　溶解后 ,加入 :

　　苯酚 2 g

　　甘油 15 mL

　　混匀 ,在棕色瓶中室温贮存 。

　　6

　　GB/T 28630.4—2012

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　甲壳类动物疾病诊断采样原则与方法

　　B. 1 采样目的

　　甲壳类动物的疾病诊断通常出于三个目的之一 :

　　a) 疾病流行状况的监测 ;

　　b) 种苗或场地的健康证书 ;

　　c) 疾病发生后的诊断 。

　　对于不同目的进行分析所需的样品类型和数量极不相同 。

　　B. 1. 1 疾病发生后的诊断

　　在临床发病的情况下 ,应从活的或濒死的甲壳类动物中仔细选择带有特征性病灶的高质量标本 ,强调标本应具有代表性 ,并且是濒死的或临床发病的 。避免采集死后的标本 ,采样时要根据诊断方法考虑样品所需的保存条件 。

　　要对已发生的疾病进行诊断 ,建议最少采集 100个幼体标本 , 50个后期幼体(如仔虾 、仔蟹) 标本 、 10个稚体(如幼虾 、稚蟹)或成体(如成虾 、亲蟹等)的标本 。如果临床病症明显 ,可采集更多的数量 。不过 ,上述推荐的 “最少 ”数量只是一个指导性的参考量 ,应强调仔细选择标本的质量比随便捡出上百个标本来充数要更有价值得多 。

　　B. 1. 2 对无症状的甲壳类动物的诊断

　　要监测疾病流行情况 、或检测无症状感染的病原 、或核准健康证书 ,所需的采样数量就应该用统计学方法来确定 。先假定感染的检出率大于或等于 2%、5%、10%、20%等 ,再对不同大小的群体计算所需的最少样品数量 ,该数量应能使样品中出现感染标 本 的 概 率 满 足 95%的 可 信 限 。 对 不 同 大 小 的 群体 ,所需要的采样数量已被计算成预定的表格(参见表 B. 1) 。

　　为了监测疾病流行或核准 健 康 证 书 , 对 不 同 大 小 的 群 体 进 行 诊 断 所 需 的 样 品 数 量 应 与 表 B. 1 相符 ,并取其最低的假定检出率 , 即 2% 。

　　为了诊断群体中似乎存在的无症状感染 ,可假定检出率高于 5% ,从表 B. 1查出所需的采样数量 。

　　表 B. 1 各种大小的群体在推测病原检出率不同时满足 95%可信限的采样数量

　　群体大小

　　各假定检出率的采样数量

　　2%

　　5%

　　10%

　　20%

　　30%

　　40%

　　50%

　　50

　　50

　　35

　　20

　　10

　　7

　　5

　　2

　　100

　　75

　　45

　　23

　　10

　　9

　　7

　　6

　　250

　　110

　　50

　　25

　　10

　　9

　　8

　　7

　　500

　　130

　　55

　　26

　　10

　　9

　　8

　　7

　　1 000

　　140

　　55

　　27

　　10

　　9

　　9

　　8

　　1 500

　　140

　　55

　　27

　　10

　　9

　　9

　　8

　　7

　　GB/T 28630.4—2012

　　表 B. 1 (续)

　　群体大小

　　各假定检出率的采样数量

　　2%

　　5%

　　10%

　　20%

　　30%

　　40%

　　50%

　　2 000

　　145

　　60

　　27

　　10

　　9

　　9

　　8

　　4 000

　　145

　　60

　　27

　　10

　　9

　　9

　　8

　　10 000

　　145

　　60

　　27

　　10

　　9

　　9

　　8

　　≥100 000

　　150

　　60

　　30

　　10

　　9

　　9

　　8

　　注 : 表格中的采样数量是指实际被有效分析的样品数 ,如果所采集到的样品不一定每份都能分析到 ,则应采集更多样品 。例 :对于 100 000尾仔虾的群体来说 ,在 60尾样 品 中 查 出 3 尾 阳 性 ,则 该 群 体 存 在 5%病 原 检 出 率的结果具有 95%的可信度 。

　　对不同病原的监测 ,还应注意最适于采样的生活期有差异 。例如 ,要监测对虾杆状病毒病 、斑节对虾杆状病毒病或杆状病毒的中肠腺坏死 ,最佳采样期是幼体和早期仔虾 ;要监测涛拉病 、白斑综合征和黄头病 ,最佳采样期是幼虾和亚成年虾 ;要监测螯虾瘟 ,最佳采样期是幼螯虾和成年螯虾 。

　　B. 2 不同诊断方法所需样品的采集要求

　　B. 2. 1 直接显微镜检查或组织印片/涂片染色检查的样品

　　用于直接镜检的样品应在采集后立即处理 ,起码要求能做到制备好风干的组织印片或涂片 。

　　待检样品尽可能使用活标本 ,如果得不到活标本 , 至少也应使用冰鲜或用缓冲的 10%甲醛(37%)固定的标本 。

　　B. 2. 2 组织学诊断的样品

　　B. 2. 2. 1 采样时样品要求

　　采样时 ,应尽量减轻 对 动 物 造 成 的 胁 迫 , 固 定 前 需 要 运 输 或 临 时 暂 养 时 要 保 证 水 中 有 充 足 的 含氧量 。

　　B. 2. 2. 2 固定液要求

　　准备好充足的固定液 ,一般原则是一体积的组织样品最少应十倍体积的固定液(例如 , 10g 对虾组织应要 100mL 固定液) 。

　　大多数组织学诊断都可使用戴维森氏 AFA 固定液(见附录 A) 。该固定液可快速渗透 , 能有效阻止甲壳类的组织自溶 ,且其酸性可使甲壳脱钙 。

　　如果样品要准备进行免疫组织化学分析或进行 RNA 病毒的原位杂交诊断 , 可采用非酸性的 R-F固定液(见附录 A) 。但 R-F 固定液不应该用于常规组织学样品的固定 , 因为它对组织的渗透较慢 ,且不能使甲壳脱钙 ,用它固定的组织可能会导致切片和染色困难 。

　　B. 2. 2. 3 不同样品的固定方法

　　幼体和仔虾 :用细筛绢或吸管选取标本 。将采集的个体直接浸入 10倍体积的固定液中 , 固定 12 h~ 24h,然后转移到 70%乙醇中长期保存 。

　　大的仔虾和小的幼虾 :按上述方法选取并采集标本 。用注射针尖或解剖刀尖划破甲壳 ,将采集的个

　　8

　　GB/T 28630.4—2012

　　体直接浸入 10倍体积的固定液中 , 固定 12 h~ 24h,然后转移到 70%乙醇中长期保存 。

　　大的幼 虾 以 及 成 虾 : 用 注 射 器 将 体 重 5% ~ 10%的 固 定 液 注 射 到 活 虾 体 内 。先 对 肝 胰 腺 区 域 分2处 ~ 3处进行注射 ,然后将固定液注射到第 1、第 3 和第 6 腹节 。 头胸部 ,特别是肝胰腺区域应该多注射一些 。注射使虾完全死亡 ,然后立即用解剖刀片划开甲壳 ,在头胸区的划 口沿着头胸甲中线的右侧 ,在腹节区的划口沿着腹节右 侧 的 中 部 。 再 将 个 体 浸 入 10倍 体 积 的 固 定 液 中 , 固 定 24 h, 然 后 转 移 到70%乙醇中长期保存 。

　　体重大于 12 g 的虾或蟹 :按上述方法注射并划破甲壳 ,然后将虾体在头胸和腹节连接处的后面横切 ,如果虾体较大 ,再在腹节中部横切 。将各部分浸入 10倍体积的固定液中 , 固定 24 h,如果个体较大或甲壳较硬 ,应延长固定时间 ,直到 72 h,然后转移到 70%乙醇中长期保存 。

　　个体很大的虾或蟹 :注射固定液后 ,对个体解剖 , 取出应进行组织学分析的组织或器官 , 分别浸入10倍体积的固定液中 , 固定 12 h~ 24h,然后转移到 70%乙醇中长期保存 。

　　B. 2. 2. 4 样品编号、登记和标签

　　在采集样品时应对标本进行编号和登记 ,并根据编号记载标本的全部说明档案 ,包括标本种名 、龄期 、重量或大小 、来源 、个体症状 、群体健康状态以及其他相关信息 。

　　要使用抗水的纸条或毛面塑料纸做样品标签 ,并用 2B铅笔在标签上注明标本登记编号及其主要说明 ,将标签直接放入与该标本相同的含固定液包装中 ,不要用钢笔 、圆珠笔或记号笔作标签 。

　　B. 2. 2. 5 样品的包装和运输

　　大体积的固定液或含 乙 醇 溶 液 不 能 进 行 邮 寄 或 运 输 , 样 品 运 输 前 应 进 行 相 应 的 处 理 。 在 运 输 前12 h,将样品从 70%乙醇中转移到 50%的乙醇中保存以降低样品中的乙醇含量 。

　　包装前将样品从 50%乙醇中取出 。幼体 、仔虾或小的幼虾标本转移到具密封圈的螺口聚丙烯塑料管中 ,放入标签 ,再填充少许吸水纸 ,然后用 50%乙醇浸透 ,盖紧管帽 ;较大的标本用 3 层 ~ 5 层白色纸巾完全包裹 ,将纸巾包裹的标本放入一个厚的聚丙烯 塑 料 袋 中 , 用 50%乙 醇 浸 透 纸 巾 , 在 袋 内 放 入 标签 ,将塑料袋用热塑封口机熔封 。

　　将上述塑料管或塑料袋用 2层吸水纸包裹 ,放入一个厚塑料袋中并完全密封 。 多个小塑料袋再封入一个较大的塑料袋内 ,最后所有的塑料袋放入一个抗压的运输用包装箱内 ,填入防压充填物 ,进行邮寄或运输 。

　　B. 2. 2. 6 组织学标本修整的取材

　　从 50%或 70%的乙醇保存液中取出固定好的标本 ,置于木头或塑料垫板上 ,根据标本的大小进行修整 , 以便确保感兴趣的组织能被有效切片 。

　　幼体或仔虾 :用擦镜纸将个体包好 ,放于脱水盒中进行脱水 ,包埋时去掉擦镜纸 ,用热镊子调整标本在包埋模具中的位置进行整体包埋 。

　　小于 3 cm 的幼虾 :用单面刀片或解剖刀沿对虾的中线右侧将标本纵剖两半 。如果虾体较长 ,再从第 2腹节处横切两半 。取包含中线的左侧进行脱水 ,包埋时纵切面向下包埋 。

　　大于 3 cm 的幼虾或亚成年虾 :用单面刀片或解剖刀从对虾的头胸和腹节连接处切断 ,再将头胸沿中线右侧纵剖两 半 。 取 包 含 中 线 的 左 侧 , 切 去 步 足 80%的 长 度 , 剔 净 胃 内 容 物 ; 如 果 头 胸 长 度 大 于1 cm ,切取包含胃部和肝胰腺部分的 1cm 以下的部分 ;如果厚度大于 0. 5cm ,削去高出 0. 5cm 的部分 。再从不含中线的右侧头胸部斜切下鳃区 。将切取的含中线左侧头胸部和切下的鳃区放入同一个脱水盒进行脱水 ,包埋时将含中线左侧头胸部的纵切面向下 ,鳃区的纵切面向上 ,前后对错地放入同一个包埋模具中包埋 。如果需要对腹 节 部 分 进 行 组 织 学 分 析 , 选 取 感 兴 趣 的 腹 节 或 第 1、第 3 和 第 6 腹 节 , 从第 1 和第 3腹节横切出厚度不超过 0. 5 cm 的段 ,对第 6腹节纵切 ,分别脱水和包埋 。

　　9

　　GB/T 28630.4—2012

　　大于 8 cm 的虾或蟹 :参照上述修整方法 ,按照长宽不超过 1 cm×1 cm ,厚度不超过 0. 5 cm 的要求对感兴趣的组织所在的区域进行修整 ;对特定的组织或蟹的组织 ,也可考虑进行横切 ,甚至独立地解剖出相应的组织器官 ,按需要分别进行脱水和包埋 , 胃和肠道中的内容物应剔除干净以免损伤切片刀 。

　　B. 2. 3 分子生物学或免疫学诊断的样品

　　B. 2. 3. 1 样品采集和保存要点

　　用于 PCR、RT-PCR或核酸探针斑点杂交检测的样品应注重保护病原的核酸 。用于抗体的免疫分析检测的样品应注重保护病原的抗原活性 。

　　用于核酸检测或抗体检测的样品应十分小心地防止各样品间的交叉污染 ,每个样品应使用新的 一次性塑料袋或塑料管和内置标签 。

　　不同的样品采集和保存方法对不同的检测方法的适用性有差异 ,并且可能应增加一些辅助的样品处理手段 ,因此在样品采集和运输时要注明曾使用过的保存条件 ,使实验室能根据其保存条件进行相应处理。

　　B. 2. 3. 2 不同类型样品的采集和运输

　　B. 2. 3. 2. 1 活标本 :活标本可在现场处理或以活体形式运输到诊断实验室 。

　　B. 2. 3. 2. 2 血淋巴 :许多分子生物学或免疫学检测的首选样品是血淋巴 ,样品可用注射器从心脏 、腹部血窦采集 ,或切断附肢采集 。

　　B. 2. 3. 2. 3 冷藏标本 :应经 24h 以内运输到实验室进行分子生物学或免疫学检测的样品可采用这种方法保藏 。运输前 ,应将各样品独立装袋 ,用足量的冰将样品塑料袋埋入泡沫塑料箱中 ,进行合适的包装后运输到实验室 。

　　B. 2. 3. 2. 4 深冻标本 :采集活标本 ,用干冰或用低于 -20℃的冰柜速冻 ,将标签放入独立的样品包装袋 ,用足量的干冰将样品包装袋埋入泡沫塑料箱中 ,进行合适的包装后可满足较苛刻的运输要求 。

　　B. 2. 3. 2. 5 乙醇保存的样品:对于难以用冷藏或冷冻方法存放和运输样品的情况 ,可用 90% ~ 95%的乙醇来保存和运送某些类型的样品 。小于 2 g~ 3 g 的个体 、解 剖 出 的 组 织 或 抽 取 的 血 淋 巴 可 保 存 于90%~ 95%的乙醇中 ,做好相应标签 ,运输前 1 h,将保存的标本转移到 50%的乙醇中 ,然后按 B. 2. 2. 5的方法进行包装和运输 。

　　B. 2. 3. 2. 6 特殊采样液保存的样品:一些特定的分子生物学或免疫学检测方法或试剂盒提供了样品的采集 、保存和运输用试剂 ,可为样品的保存 、运输和后续的检测操作提供便利 。如 SEMP-SSC采样液可用于斑点杂交检测的核酸样品的保存和运输 、SEMP-Tris采样液可用于 PCR 和核酸探针检测的核酸样品保存和运输 ,TrizolTM1) 可用于 RT-PCR样品的保存和运输等 。但要注意 ,不同的采样液保存的样品通常只适用于该试剂指定的检测方法 ,而并不一定适于进行其他的诊断 。

　　1) 这是适合的市售产品的实例 。给出这一信息是为了方便本标准的使用者 ,并不表示对这一产品的认可 。

　　10