GB/T 28095-2011 木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28095—2011

　　木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofPhellinusnoxius(Corner) G. Cunn.

　　2011-12-30发布 2012-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28095—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271) 提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国宁波出入境检验检疫局检验检疫技术中心 、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :张建成 、陈先锋 、丁国云 、张慧丽 、戴忠军 、张培 、王良华 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28095—2011

　　木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了木层孔褐根腐病菌 Phellinusnoxius的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于木材和苗木上的木层孔褐根腐病菌的检测和鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T 12728 食用菌术语

　　SN/T 1126 进出境木材检疫规程

　　SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程

　　3 术语和定义

　　GB/T 12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　平伏反卷 effused-reflexed

　　担子果在基物上的着生形态 ,其一部分贴附于基物上 ,边缘翘起反卷形成檐状 、条状 、半圆形或扇形菌盖 ,有时呈覆瓦状叠生 。整个担子果贴附于基物上 ,不形成菌盖的形态称为平伏(effused) 。

　　3. 2

　　生殖菌丝 generativehyphae

　　担子果中基本的菌丝类型 。 在刺革菌科( Hymenochaetaceae) 种类中 , 生殖菌丝只形成简单分隔 ,不形成锁状联合 ,通常无色 、浅黄色或浅黄褐色 ,薄壁或厚壁 ,分枝或很少分枝 。

　　3. 3

　　刚毛状菌丝 setalhyphae

　　在菌肉或菌髓中形态像菌丝 ,但明显比菌丝宽 ,且具有厚壁 ,顶端尖锐的结构 。

　　4 木层孔褐根腐病菌基本信息

　　中文名 :木层孔褐根腐病菌 。

　　学名 :Phellinusnoxius(Corner) G. Cunn. 1965。

　　异名 :Fomesnoxius Corner1932;Phellinidiumnoxium(Corner)Bondartseva & S. Herrera1992。

　　病害英文名 :brown rootrotdisease。

　　属真菌界 Fungi,担子菌门 Basidiomycota,担子菌纲 Basidiomycetes,刺革菌 目 Hymenochaetales,刺革菌科 Hymenochaetaceae,木层孔菌属 Phellinus。

　　木层孔褐根腐病菌的其他信息参见附录 A。

　　1

　　GB/T 28095—2011

　　5 方法原理

　　根据木层孔褐根腐病菌在寄主植物上的症状 ,抽取可疑样品进行病原菌分离培养 ,根据病原菌的形态特征 、生物学特征和 PCR特异性反应对病菌进行鉴定 。

　　6 仪器和用具

　　6. 1 仪器设备

　　体视显微镜 、显微镜(具 100×油镜和测微尺) 、超净工作台 、生物培养箱 、冰箱 、高压灭菌器 、干热灭菌器 。

　　6. 2 实验用具

　　载玻片 、盖玻片 、滴管 、培养皿 、镊子 、解剖刀 、酒精灯 、医用手术剪 。

　　7 试剂和材料

　　7. 1 试剂

　　7. 1. 1 蒸馏水(H2 O) 。

　　7. 1. 2 5%氢氧化钾(KOH) 溶液(质量浓度) 。

　　7. 1. 3 棉蓝试剂 :棉蓝(苯胺蓝)0. 5 g、乳酸 60mL。

　　7. 1. 4 Melzer试剂 :碘(I2 )0. 5 g、碘化钾(KI)1. 5 g、水 20g、水合氯醛 22. 5 g。

　　7. 2 培养基

　　7. 2. 1 大麦提取物琼脂(MEA) 培养基

　　大麦提取物(MaltExtract) 20 g,琼 脂(Agar) 20 g,加 蒸 馏 水 至 1 000 mL。 121 ℃高 压 湿 热 灭 菌30min,倒平板备用 。

　　7. 2. 2 选择性培养基

　　MEA培养基灭菌后 ,待冷却至 40℃ ~ 50℃ ,加入 100mg氨苄青霉素 , 10mg氯硝胺 , 10mg苯菌灵 ,500mg没食子酸 ,混匀倒平板 。

　　7. 2. 3 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA) 培养基

　　自行配制或使用市售 PDA培养基 。

　　8 现场检测

　　取样和抽样按照 SN/T 1157或 SN/T 1126方法进行 。

　　取样时应进行针对性检查 ,检查有无可疑症状 ,重点观察茎干基部 1m 范围内区域及根系是否包裹褐色菌丝层 ;剥去树皮 ,观察树木组织是否白色腐朽 ,有无褐色网纹状菌丝束 ;腐烂树木表面是否有真菌子实体 。直接挑出带有可疑症状的货物 ,将可疑部分切(锯) 下 ,送实验室作进一步检验鉴定 。

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　　GB/T 28095—2011

　　9 实验室检测

　　9. 1 分离和培养

　　将带病材料用自来水冲洗干净 ,洁净吸水纸吸干 。去除树皮 ,用消毒的解剖刀片将内部病组织切成约 3 mm×3 mm×6 mm 小块 ,置于选择性培养基平板上 ,每个培养皿放置 5块 ,梅花状排列 ,30℃黑暗培养 5d~ 10d。选择性培养基上的褐色菌落转移到 MEA培养基或 PDA培养基 30℃黑暗培养 。长满平板后 ,检查培养性状 ,在光学显微镜下观察菌丝形态特征 。

　　9. 2 子实体观察

　　如发现病菌子实体 ,采用宏观形态观察和显微切片方法检测 。

　　宏观形态观察使用体式显微镜 ,观察子实体的形态 、色泽 、菌盖 、菌孔等特征 。

　　显微切片检测方法 ,使用干标本制作成徒手切片 , 以蒸馏水 、Melzer试剂和 5%氢氧化钾溶液分别做为浮载剂 ,在显微镜下观察菌丝及子实层中的担孢子 、担子 、菌髓等微观特征 。显微测量和摄像均在棉蓝试剂包埋的切片中进行 。孢子测量 30个 ,其他结构如菌丝直径 、担子大小等均测量 10个 ,取极小值与极大值 ,宽度测量于其结构的最宽部位 ,长度测量于其顶端至基部分隔处 。

　　9. 3 PCR检测方法

　　培养物菌丝或病组织中病菌 DNA提取和 PCR检测方法见附录 B。

　　引物 PN-1F/PN-2R扩增病菌 DNA,得到 414bp或 422bp扩增产物 ,则为 PCR检测阳性 ,反之 ,为阴性 。所有真菌 DNA均可与通用引物 ITS-1和 ITS-2结合扩增产生 300bp左右的 DNA 片段 。

　　10 鉴定特征

　　10. 1 寄主上症状

　　树木根和茎基部表面多形成一层厚厚的黑褐色到黑色菌丝壳 ,坚硬 ,油浸状表面 ,根部菌丝壳常与泥沙结合不明显 。潮湿时 ,茎部菌丝壳的延伸边缘乳白色 ,约 2 cm 宽 ,带有澄清褐色的渗出液滴 。 (参见图 C. 1) 树皮易剥落 ,病害引起软而脆的蜂窝状白色腐烂 ,受感染树皮内侧组织具不规则暗褐色菌丝束形成的网纹(参见图 C. 2) 。

　　10. 2 无性阶段特征

　　10. 2. 1 培养性状

　　在含有没食子酸 MEA培养基上 ,能产生扩散性的暗褐色色素 。菌落不规则 ,菌落前缘菌丝气生至平伏 ,初始白色至草黄色 ,渐渐转为黄褐色至褐色 ,有褐色网纹(参见图 D. 1) 。

　　10. 2. 2 显微特征

　　菌丝透明到褐色 ,不产生锁状联合 ,一般能够产生节孢子和毛状菌丝 。节孢子(参见图 D. 2) 由菌丝断裂形成 ,与菌丝同色 ,球形到卵形 。毛状菌丝(参见图 D. 3) 鹿角状 ,菌丝分叉生长 ,表面有刺状突起 。

　　10. 3 子实体形态

　　10. 3. 1 整体特征

　　子实体单生 ,无柄 ,大小不一 ,平伏或平伏反卷形成窄的菌盖(参见图 C. 3 和图 C. 4) ,长可达10cm ,

　　3

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　　宽可达 6 cm ,基部厚可达 2. 5 cm;平伏时长可达 40cm ,宽可达 15cm。新鲜时硬革质或软木栓质 ,无嗅无味 ,干后硬木质 。菌盖表面暗褐色至黑色 ,具不规则的环带 ,光滑 。孔口表面灰褐色至暗褐色 ,不育的边缘明显 ,孔口圆形 ,每毫米 7个 ~ 8个 ,孔口边缘薄而全缘 。

　　10. 3. 2 微观结构

　　子实体切片分为 3部分 ,最上层表皮为一明显的黑色薄皮壳 , 中间菌肉层 ,下层菌管层 。菌肉黄褐色 ,具同心环带 ,菌肉和菌管之间有一条黑色细线相间 。菌管褐色 。微观结构参见图 D. 4。具体结构如下 :

　　a) 菌丝结构 :担子果内只存在生殖菌丝 ;菌肉中菌丝为菌肉菌丝 ,菌管为子实层体 ,其中的菌丝为菌髓菌丝 ,菌髓菌丝与菌肉菌丝相似 ; 所有隔膜无锁状联合 ; 在 5% KOH 试剂中菌丝组织颜色变黑 ,对 Melzer试剂无变色反应 ,在棉蓝试剂中略变蓝色 。担子果菌髓里的刚毛状菌丝顶端钝而菌肉里的刚毛状菌丝顶端锐 ,是子实体的最重要的鉴定特征 。

　　b) 菌肉 :生殖菌丝无色 ,薄壁 ,偶尔分枝 ,常具隔膜 ,平直 ,规则排列 ,直径为 4 μm~ 7 μm;刚毛状菌丝褐 色 至 暗 褐 色 , 厚 壁 , 内 腔 宽 , 通 常 末 端 尖 , 起 源 于 黄 色 厚 壁 菌 丝 , 长 达 数 百 微 米 , 直 径5 μm~ 10μm。

　　c) 菌管 :生殖菌丝很少分枝 ,常具隔膜 ,略平行排列 ,相互紧密黏结 ,直径为 3 μm~ 6 μm。 刚毛状菌丝明显 ,厚壁并具一狭窄的内腔 ,顶端圆钝 ,长达数百微米 ,最宽处直径为 7 μm~ 14. 5 μm。子实层通常在后期消解 ;囊状体棍棒状 ,具长而尖锐的顶部 , 薄壁 , 大小为(16μm~ 21μm) × (4μm~ 5 μm) ;担子近棍棒状 ,大小为(12μm~ 16μm) × (3. 5 μm~ 4 μm) ;次生菌丝丰富 ,无色 ,薄壁 ,常分枝 ,直径为 3 μm~ 5 μm。

　　d) 孢子 :担孢子椭圆形或倒卵形 ,无色 ,薄壁 ,大小为(4μm~ 6 μm) × (3μm~ 5 μm) 。

　　10. 4 木层孔褐根腐病菌与其近似种的主要区别

　　木层孔褐根腐病菌与其近似种橡胶木层孔菌的主要区别参见附录 E。

　　11 结果判定

　　11. 1 检出子实体 ,符合 10. 3 的鉴定特征 ,可直接判为木层孔褐根腐病菌 。

　　11. 2 未检出子实体 , 为 害 症 状 、无 性 阶 段 培 养 特 征 符 合 10. 1~ 10. 2 鉴 定 特 征 , 判 为 木 层 孔 褐 根 腐病菌 。

　　11. 3 未检出子实体 ,为害症状不明显 ,分离得到符合 10. 2 鉴定特征的真菌 ,PCR 特异性反应阳性 ,可判为木层孔褐根腐病菌 。

　　12 标本和样品保存

　　鉴定为木层孔褐根腐病菌的病木保存至少 12个月 。

　　选择适当的病原菌材料制成永久玻片 ,分离获得的木层孔褐根腐病菌分离物转移到 MEA 斜面培养基或 PDA斜面培养基或灭菌蒸馏水室温黑暗保存 ,每 6 个月转接到新的培养基上保存 ,并严格防止扩散 。妥善保存实验原始记录等材料 , 以备复验 、谈判和仲裁 。

　　样品和菌株保存期满后 ,经高温高压灭菌处理 。

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　　GB/T 28095—2011

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　木层孔褐根腐病菌其他信息

　　A. 1 分布

　　亚洲 : 巴基斯坦 ,菲律宾 ,马来西亚(西马来西亚 、沙巴 、沙捞越) ,缅甸 ,斯里兰卡 , 印度(喀拉拉邦 、马德拉斯 、迈索尔 、东北地区 、北方邦 、安达曼群岛 、尼科巴群岛) , 印度尼西亚(爪哇 、苏门答腊) ,越南 , 中国(台湾) 。

　　非洲 :安哥拉 ,贝宁 ,布基纳法索 ,多哥 , 刚果 ,加纳 ,加蓬 ,喀麦隆 ,科特迪瓦 ,肯尼亚 ,尼 日利亚 ,塞拉利昂 ,坦桑尼亚 ,乌干达 , 中非 。

　　美洲 : 巴西 ,波多黎各 ,法属圭亚那 ,哥斯达黎加 ,古巴 。

　　大洋洲 :澳大利亚(昆士兰) , 巴布亚新几内亚 ,北马里亚纳群岛(美属) ,斐济 ,美属萨摩亚 ,所罗门群岛 ,瓦努阿图 ,西萨摩亚 ,新西兰 。

　　A. 2 寄主

　　木层孔褐根腐病菌寄主范围很广 ,寄主包括 56科近 200种植物(见表 A. 1) 。

　　表 A. 1 木层孔褐根腐病菌的寄主

　　学 名

　　中文名

　　学 名

　　中文名

　　Acaciaaulacocarpa

　　纹荚相思

　　Artemisiacapillaris

　　茵陈蒿

　　Acaciaconfusa

　　台湾相思

　　Artemisiaprinceps

　　魁蒿 ,艾草

　　Acaciamangium

　　马占相思

　　Artocarpusheterophyllus

　　木菠萝

　　Actinodaphnepedicellata

　　小梗木姜子

　　Averrhoacarambola

　　杨桃

　　Agathisrobusta

　　昆士兰贝壳杉

　　Barleriacristata

　　假杜鹃

　　Albizialebbeck

　　大叶合欢

　　Bauhiniapurpurea

　　红花羊蹄甲

　　Albizia sp.

　　合欢属

　　Bauhinia sp.

　　羊蹄甲属

　　Aleuritesfordii

　　油桐

　　Bauhiniavariegata

　　宫粉羊蹄甲

　　Aleuritesmoluccana

　　石栗

　　Bauhiniahybrid

　　艳紫荆

　　Alstoniascholaris

　　糖胶树

　　Bischofiajavanica

　　茄苳

　　Annona×squamosa-cherimola

　　凤梨释迦

　　Blepharocaryainvolucrigera

　　漆树科一种

　　Annonamontana

　　山刺番荔枝

　　Boehmerianivea

　　苎麻

　　Annonasquamosa

　　番荔枝

　　Bombaxceiba

　　木棉

　　Anonasquamosa×A. cherimola

　　凤梨释迦

　　Bougainvillea sp.

　　九重葛属

　　Araucariacunninghamii

　　南洋杉

　　Breynianivosa

　　彩叶山漆茎

　　Araucariaheterophylla

　　异叶南洋杉

　　Broussonetiakazinoki

　　小构树

　　Arecatriandra

　　三药槟榔

　　Broussonetiapapyrifera

　　构树

　　5

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　　表 A. 1 (续)

　　学 名

　　中文名

　　学 名

　　中文名

　　Cajanuscajan

　　木豆

　　Crotalariamicans

　　黄猪屎豆

　　Calocedrusformosana

　　台湾肖楠

　　Cycastaiwaniana

　　台湾苏铁

　　Calophylluminophyllum

　　琼崖海棠

　　Dalbergiasissoo

　　印度黄檀

　　Camelliajaponica

　　山茶

　　Delonixregia

　　凤凰木

　　Camelliajaponica var. japonica

　　凤凰山茶

　　Dimocarpuslongan

　　龙眼

　　Camelliasinensis

　　茶

　　Diospyrosferreavar. buxifolia

　　象牙树

　　Cassiafistula

　　腊肠树

　　Diospyroskaki

　　柿树

　　Cassiagrandis

　　红花铁刀木

　　Diospyrosoldhamii

　　红柿

　　Cassia sp.

　　铁刀木属

　　Durantarepens

　　假连翘

　　Casuarinaequisetifolia

　　木麻黄

　　Elaeisguineensis

　　油棕

　　Cedrelamexicana

　　墨西哥洋椿

　　Elaeocarpusserratus

　　锡兰橄榄

　　Ceibapentandra

　　爪哇木棉

　　Eriobotryajaponica

　　枇杷

　　Cerberamanghas

　　海芒果

　　Erythrinavariegate

　　刺桐

　　Chamaecyparisformosensis

　　红桧

　　Eucalyptuscamaldulensis

　　赤桉

　　Chlorophoraexcelsa

　　绿柄桑

　　Eucalyptuscitriodora

　　柠檬桉

　　Chorisiaspeciosa

　　美人树

　　Eucalyptusdrepanophylla

　　纤脉桉

　　Chrysalidocarpuslutescens

　　散尾葵

　　Eucalyptusgrandis

　　巨桉

　　Cinnamomum camphora

　　樟树

　　Ficuselastica var. elastica

　　印度橡胶树

　　Cinnamomum kanehirai

　　牛樟

　　Ficushanceana

　　桑科一种

　　Cinnamomum zeylanicum

　　锡兰肉桂

　　Ficusmicrocarpa

　　榕

　　Citrusaurantifolia

　　莱檬

　　Ficuspumila var. awkeotsang

　　爱玉子

　　Citruslimon

　　柠檬

　　Ficusreligiosa

　　菩提树

　　Citrusreticulata

　　柑橘

　　Ficusstenopylla

　　竹叶榕

　　Cocosnucifera

　　可可椰子

　　Firmianasimplex

　　梧桐

　　Codiaeum variegatum

　　变叶木

　　Flemingiamacrophylla

　　大叶千金拔

　　Cofeaarabica

　　小粒咖啡

　　Flindersiabrayleyana

　　昆士兰巨盘木

　　Cofeacanephora

　　中粒咖啡

　　Fraxinusformosana

　　白鸡油

　　Cofea sp.

　　咖啡属

　　Gardeniajasminoides

　　黄栀子

　　Colanitida

　　可拉

　　Grevillearobusta

　　银桦

　　Cordiadichotoma

　　破布木

　　Hederaaustraliana

　　五加科一种

　　Crataegussp.

　　山楂

　　Heveabrasiliensis

　　巴西橡胶树

　　Crescentiacujete

　　葫芦树

　　Hevea sp.

　　橡胶树

　　Crotalariaanagyroides

　　三尖叶猪屎豆

　　Hibiscusrosa-sinensis

　　朱槿

　　Cryptocaryaconcinnai

　　海南厚壳桂

　　Hibiscusschizopetalus

　　裂瓣朱槿

　　Cupressuslusitanica

　　墨西哥柏木

　　Hibiscustiliaceus

　　黄槿

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　　表 A. 1 (续)

　　学 名

　　中文名

　　学 名

　　中文名

　　Hydrangeachinensis

　　中国绣球

　　Ochromalagopus

　　轻木

　　Ipomoeapescaprae

　　马鞍藤

　　Osmanthusfragrans

　　桂花

　　Keteleeriadavidiana var.formosana

　　台湾油杉

　　Pachiramacrocarpa

　　马拉巴栗

　　Kigeliapinnata

　　腊肠树

　　Palaquiumformosanum

　　大叶山榄

　　Kissodendronaustralianum

　　五加科一种

　　Peltophoruminerme

　　盾柱木

　　Koelreuteriahenryi

　　台湾栾树

　　Perseaamericana

　　鳄梨

　　Lactucaindica

　　山莴苣

　　Perseagratissima

　　鳄梨

　　Lagerstroemiaspeciosa

　　大花紫薇

　　Pinuselliottii

　　湿地松

　　Lagerstroemiaturbinata

　　棱萼紫薇

　　Pinuselliottii var. elliottii

　　湿地松

　　Lantanacamara

　　马缨丹

　　Pinusthunbergii

　　黑松

　　Leucaena×glabrata-leucocephala

　　银合欢

　　Pipernigrum

　　胡椒

　　Leucaenaleucocephala

　　银合欢

　　Pistaciachinensis

　　黄连木

　　Liquidambarformosana

　　枫香