GB/T 27521-2011 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法

　　ICS 11. 220 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 27521—2011

　　猪流感病毒核酸 RT-PCR检测方法

　　RT-PCR assayforswineinfluenzavirusnucleicacid

　　2011-11-21发布 2012-03-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 27521—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 , 中国检验检疫科学研究院 , 中国兽医药品监察所 。

　　本标准主要起草人 :乔传玲、韩雪清、杨焕良、刘业兵、陈艳、吴绍强、陈化兰、林祥梅、辛晓光、朱中武、王慧煜 、刘建 、李建 、梅琳 、王伊琴 、徐彪 、阮周曦 、宁宜宝 、薄清如 、秦智锋 、林志雄 。

　　Ⅰ

　　GB/T 27521—2011

　　猪流感病毒核酸 RT-PCR检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了猪流感病毒核酸 RT-PCR检测方法的技术要求 。

　　本标准规定的 RT-PCR检测方法适用于检测猪肺脏组织 、鼻腔及气管分泌物和这些采集样品培养物中的猪流感病毒核酸 。

　　2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　DEPC:焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)

　　dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)

　　EB:溴化乙锭(ethidium bromide)

　　M-MLV RT: 莫 洛 尼 氏 鼠 白 血 病 病 毒 反 转 录 酶 (moloney murine leukemia virus reverse tran- scriptase)

　　PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　RNA:核糖核酸(ribonucleic acid)

　　RNAase inhibitor:RNA酶抑制剂

　　RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(reverse-transcription polymerase chain reaction)

　　SPF:无特定病原体(specific pathogen free)

　　TaqDNA polymerase:TaqDNA 聚合酶

　　3 仪器

　　3. 1 PCR仪 。

　　3. 2 台式低温高速离心机 。

　　3. 3 电泳仪 。

　　3. 4 电泳槽 。

　　3. 5 冰箱 。

　　3. 6 凝胶成像系统 。

　　3. 7 微量移液器 。

　　3. 8 水浴锅 。

　　4 试剂

　　4. 1 LS TRIzolRNA提取试剂或其他商品化的 RNA提取试剂 。

　　4. 2 氯仿 、异丙醇 、无水乙醇 。

　　4. 3 1. 2%琼脂糖凝胶 ,见附录 A 中 A. 1。

　　4. 4 50×TAE缓冲液 ,见附录 A 中 A. 2。

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　　4. 5 溴化乙锭(EB,10 μg/μL)或核酸染料 ,见附录 A 中 A. 3。

　　4. 6 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水 ,见附录 A 中 A. 4。

　　4. 7 DNA分子量标准(100bp) 。

　　4. 8 M-MLV反转录酶 。

　　4. 9 RNA酶抑制剂 。

　　4. 10 TaqDNA 聚合酶 。

　　4. 11 dNTP。

　　4. 12 商品化的一步法 RT-PCR 反应试剂 。含有 RT-PCR 缓冲液 ,酶混合物 , dNTP混合物 ,无 RNA酶的水等 。

　　5 引物

　　5. 1 反转录引物见附录 B 中 B. 1。 引物浓度为 20 pmol/μL。

　　5. 2 PCR 引物见附录 B 中 B. 2。 引物浓度均为 20 pmol/μL。

　　6 样品对照

　　以灭活的猪流感病毒感染 SPF鸡胚尿囊液或者感染动物的组织作为阳性对照 , 以正常 SPF鸡胚尿囊液或者正常动物组织作为阴性对照 。

　　7 操作步骤

　　7. 1 样品的采集及处理

　　7. 1. 1 采样工具

　　下列采样工具应经 121 ℃ ±2 ℃ ,15 min高压灭菌并烘干 :

　　a) 棉拭子 ;

　　b) 剪刀 ;

　　c) 镊子 ;

　　d) 1. 5 mL离心管 ;

　　e) 研钵 。

　　7. 1. 2 活猪

　　取鼻拭子 。采集方法如下 :将棉拭子深入鼻腔旋转 ,取鼻腔分泌液 ;将采样后的拭子分别放入盛有1. 0 mL PBS(见附录 A 中 A. 5)的 1. 5 mL离心管中 ,加盖 、编号 。

　　7. 1. 3 病死猪

　　取肺脏或气管分泌物等 。采集方法如下 :用无菌镊子和剪刀采集肺脏等 ,装入一次性塑料袋或其他灭菌容器 ,编号 。

　　7. 1. 4 样品贮运

　　样品采集后 ,放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋) ,于保温箱中加冰 、密封 ,24 h内送实验室 。

　　2

　　GB/T 27521—2011

　　7. 1. 5 样品处理

　　7. 1. 5. 1 棉拭子处理方法

　　样品在混合器上充分混合后 ,用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出 ,弃去拭子 , 室温静置 30 min, 4 ℃ 、3 000 r/min离心 15 min,取上清液转入无菌的 1. 5 mL离心管中 ,编号备用 。

　　7. 1. 5. 2 脏器处理方法

　　将所采组织病料置于洁净 、灭菌并烘干的研磨器中 ,按质量体积比(1 ∶ 1)加入样品保存液进行充分研磨;4 ℃ 、3 000 r/min离心 15 min,取上清液转入无菌的 1. 5 mL离心管中 ,编号备用 。

　　7. 2 RNA 的提取

　　7. 2. 1 用 LS TRIzol试剂提取待检样品 、阳性对照及阴性对照样品的 RNA。

　　7. 2. 2 250μL样品处理液和 750 μL LSTRIzol置入一个 1. 5 mL离心管 ,振荡数次 ,静置 5 min。

　　7. 2. 3 加 200 μL氯仿 ,振荡混匀 ,室温放置 5 min,4 ℃ 12 000 r/min,离心 15 min。

　　7. 2. 4 吸取上层水相至一新离心管中 ,加入等量异丙醇 ,混匀 ,室温放置 15 min,4 ℃ 、12 000 r/min离心 15 min,离心后在离心管边和底部可见有胶样 RNA 沉淀(对于细胞毒而言 , 可能看不到沉淀) 。弃上清 。

　　7. 2. 5 小 心 吸 弃 上 清 , 加 入 500 μL 75%乙 醇(DEPC水 配 置) , 小 心 颠 倒 以 漂 洗 沉 淀 及 管 壁 , 4 ℃ 、 12 000 r/min,离心 5 min。

　　7. 2. 6 小心吸弃上清 ,沉淀置室温条件下干燥后 ,加适量 DEPC水溶解 。

　　7. 2. 7 提取的 RNA须在 2 h 内进行 RT-PCR扩增 ,若需长期保存 ,须放置 -70℃冰箱保存 。

　　7. 2. 8 也可采用商品化的基因组 RNA 提取试剂 ,按照说明书进行操作 。 同时进行阴 、阳性对照样品RNA 的提取 。

　　7. 3 RT-PCR

　　7. 3. 1 一步法反应操作步骤(如实验室有商品化的一步法 RT-PCR反应试剂采用此操作步骤)

　　7. 3. 1. 1 在 0. 2 mL反应管中依次加入 :

　　一步法 RT-PCR缓冲液 10 μL

　　dNTP(10 mmol/L) 2. 0 μL

　　酶混合物 2. 0 μL

　　RNA酶抑制剂 0. 5 μL

　　上游引物 0. 5 mL

　　下游引物 0. 5 μL

　　RNA模板 5 μL

　　DEPC水 29. 5 μL

　　上述体系根据扩增目的片段不同 ,分别选择相应的 M、H1HA、甲 H1HA、H3HA、N1NA及 N2NA单个基因的上/下游引物进行反应 。

　　7. 3. 1. 2 采用 PCR仪立即进行 RT-PCR扩增 。检测同时设立阴 、阳性对照 。

　　7. 3. 1. 3 RT-PCR反应条件为 :48 ℃ 45 min;94 ℃ 2 min;然后 94 ℃ 30 s,50 ℃ 1 min,68 ℃ 2 min,共 40个循环 ;最后 68 ℃延伸 7 min。

　　7. 3. 2 两步法反应操作步骤(如实验室没有商品化的一步法 RT-PCR反应试剂采用此操作步骤)

　　7. 3. 2. 1 RT取 5 μL RNA,加 1 μL反转录引物(Uni12) ,70 ℃水浴 5 min。

　　3

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　　7. 3. 2. 2 冰浴 2 min,继续加入 :

　　5×反转录反应缓冲液 4 μL

　　0. 1 mol/LDTT 2 μL

　　2. 5 mmol/L dNTPs 2 μL M-MLV反转录酶 0. 5 μL RNA酶抑制剂 0. 5 μL DEPC水 5 μL

　　7. 3. 2. 3 37 ℃水浴 1 h,合成 cDNA。取出直接进行 PCR或置 -20℃保存 。

　　7. 3. 2. 4 根据扩增目的片段不同 ,选择相应的上/下游引物进行扩增 。

　　PCR体系包括 :

　　双蒸灭菌水 37. 5 μL

　　反转录产物 4 μL

　　上游引物 0. 5 μL

　　下游引物 0. 5 μL

　　10×PCR Buffer 5 μL

　　2. 5 mmol/L dNTPs 2 μL

　　Taq酶 0. 5 μL

　　首先加入双蒸灭菌水 ,然后再按照顺序逐一加入上述成分 ,每一次要加入到液面下 。全部加完后 ,混匀 ,瞬时离心 ,使液体都沉降到 PCR管底 。

　　7. 3. 2. 5 PCR反应条件为 :95 ℃预变性 5 min; 94 ℃变性 45 s, 50 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 45 s,循环30次 ;72 ℃延伸 6 min。

　　8 扩增产物的电泳检测

　　制备 1. 2%琼脂糖凝胶板 ,见附录 A 中 A. 1。在电泳槽中加入 1×TAE 电泳缓冲液 ,使液面刚刚没过凝胶 。取 3 μL~ 5 μL扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后 ,加到凝胶孔 。加入分子量标准 。恒压(110V)下电泳 30 min~40 min,将电泳好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果 。

　　9 试验成立的条件

　　阳性对照的扩增产物经电泳检测 ,在预期大小的条带位置均出现特异性条带 , 阴性对照的扩增产物经电泳检测均没有预期大小的目的条带 。 阴 、阳性对照同时成立则表明试验有效 ,否则试验无效 。

　　10 结果判定

　　10. 1 阳性判定

　　应 用 引 物 M-684U/M-684L、 H1-668U/H1-668L、 甲-428U/甲-428L、 H3-668U/H3-668L、 N1-615U/N1-615L、N2-246U/N2-246L,按 照 各 基 因 检 测 体 系 对 样 品 进 行 检 测 , 扩 增 产 物 如 果 在684bp、668bp、428bp、668bp、615 bp、246bp位置出现特异性条带 ,则判定为猪流感病毒或相应亚型病毒核酸阳性 。

　　10. 2 阴性判定

　　如果在所用引物预期扩增片段的位置均未出现特异性条带 ,则判定为猪流感病毒核酸阴性 。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)相关试剂的配制

　　A. 1 1. 2%琼脂糖凝胶

　　琼脂糖 1. 2 g

　　1×TAE 电泳缓冲液 加至 100 mL

　　放入 100 mL TAE 电泳缓冲液(1×)中 ,加热融化 。 温度降至 60 ℃左右时 ,加入 5 μL核酸染料 ,均匀铺板 ,厚度为 3 mm~ 5 mm。

　　A. 2 50× TAE 电泳缓冲液

　　A. 2. 1 0. 5 mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8. 0)

　　二水乙二铵四乙酸二钠 18. 61 g

　　灭菌双蒸水 80 mL

　　氢氧化钠 调 pH 至 8. 0

　　灭菌双蒸水 加至 100 mL

　　A. 2. 2 TAE 电泳缓冲液(50× )

　　羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242 g

　　冰乙酸 57. 1 mL

　　0. 5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8. 0) 100 mL

　　灭菌双蒸水 加至 1 000 mL

　　用时用灭菌双蒸水稀释使用 。

　　A. 3 溴化乙锭(EB)溶液

　　溴化乙锭 20 mg

　　灭菌双蒸水 加至 20 mL

　　A. 4 DEPC水

　　灭菌双蒸水 100 mL

　　焦碳酸二乙酯(DEPC) 50 μL

　　室温过夜 ,121 ℃高压灭菌 15 min,分装到 1. 5 mL DEPC处理过的离心管 。

　　A. 5 PBS缓冲液

　　A. 5. 1 A 液

　　0. 2 mol/L磷酸二氢钠水溶液 。

　　5

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　　NaH2PO4 · H2 O 27. 6 g,溶于灭菌双蒸水中 ,定容至 1 000 mL。

　　A. 5. 2 B 液

　　0. 2 mol/L磷酸二氢钠水溶液 。

　　Na2 HPO4 · 7H2 O 53. 6 g(或 Na2 HPO4 · 12H2 O 71. 6 g或 Na2 HPO4 · 2H2 O 35. 6 g) ,溶于灭菌双蒸水中 ,定容至 1 000 mL。

　　A. 5. 3 0. 01mol/L、pH7. 2 磷酸盐缓冲液的配制

　　6

　　0. 2 mol/LA液

　　0. 2 mol/LB液NaCl

　　

　　14 mL

　　36 mL

　　8. 5 g

　　加灭菌双蒸水定容至 1 000 mL。

　　GB/T 27521—2011

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　引 物

　　B. 1 反转录引物

　　Uni12:5′-AGCAAAAGCAGG-3′。

　　B. 2 PCR 引物

　　引物名称

　　引物序列(5′~ 3′)

　　长度(bp)

　　扩增目的片段

　　M-684U

　　CAAGACCAATCCTGTCACCTC

　　684

　　猪流感病毒 M基因

　　M-684L

　　AAGACGATCAAGAATCCACAA

　　H1-668U

　　AGCAAAAGCAGGGGAAAATAA

　　668

　　猪流感病毒 H1亚型 HA基因

　　H1-668L

　　TGCATTCTGGTAGAGACTTTG

　　甲-428U

　　CAGCAAATCCTACAGGAATG

　　428

　　猪甲型 H1N1流感病毒 HA基因

　　甲-428L

　　GAGATGTTCCAAGTCTGATC

　　H3-668U

　　TGTTACCCTTATGATGTGCC

　　668

　　猪流感病毒 H3亚型 HA基因

　　H3-668L

　　CCCTGTTGCCAATTTCAGAG

　　N1-615U

　　TTGCTTGGTCRGCAAGTGC

　　615

　　猪流感病毒 N1亚型 NA基因

　　N1-615L

　　YCWGTCCAYCCATTWGGATCC

　　N2-246U

　　CAGTAGTAATGACTGATGG

　　246

　　猪流感病毒 N2亚型 NA基因

　　N2-246L

　　CCTGAGCACACATAACTGGA