GB/T 29429-2012 草莓角斑病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 29429—2012

　　草莓角斑病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofXanthomonasfragariae Kennedy & King

　　2012-12-31发布 2013-03-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 29429—2012

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 、中华人民共和国山东出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 。

　　本标准主要起草人 :刘天鸿 、邵秀玲 、赵文军 、杨万风 、厉艳 、魏厚德 、沙天慧 、孟祥龙 。

　　Ⅰ

　　GB/T 29429—2012

　　草莓角斑病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了草莓角斑病菌 Xanthomonasfragariae Kennedy& King的检疫鉴定以形态学特征 、生物学特征和 PCR特异性反应为依据 , 明确了样品采集 、病原菌分离 、致病性测定 、PCR 反应 、样品保存的方法 。

　　本标准适用于草莓种苗中草莓角斑病菌的检疫和鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 4789. 28—2003 食品卫生微生物学检验 染色法 、培养基和试剂

　　SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程

　　3 草莓角斑病菌基本信息

　　中文名 :草莓角斑病菌 。

　　学名 :Xanthomonasfragariae Kennedy& King。

　　病害英文名 :Angular leaf spotof strawberry。

　　属于原核生 物 界 Procaryote, 薄 壁 细 菌 门 Gracilicutes, 暗 细 菌 纲 Scotobacteria, 假 单 胞 杆 菌 科Pseudomonadaceae,黄单胞杆菌属 Xanthomonas。

　　该病菌可通过雨水和田间灌溉飞溅作局部传播 、扩散 ,携带病菌的草莓苗以及夹杂在草莓苗中的病残体都可能随贸易作短距离和长距离的运输传播 。

　　草莓角斑病菌的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　根据草莓角斑病菌的危害症状采集样品,通过实验室分离 、培养和致病性测定 , 以及分子生物学测定等方法 ,依据病害的症状 、病原菌的形态特征 、生物学特性 、生化特性 、致病性测定 , 以及分子生物学特征进行判定 。

　　5 仪器和用具

　　生物显微镜 、生化培养箱 、高压灭菌器 、电子天平(感量 0. 01 mg) 、恒温振荡培养箱 、超净工作台 、 PCR仪 、电泳装置 、恒温水浴锅 、高速冷冻离心机 、移液器 、移液器枪头 、研钵 、量筒 、烧杯 、培养皿 、PCR管 、离心管 、接种针 、玻璃棒 、剪刀等 。

　　6 主要试剂

　　蛋白胨 、酵母膏 、蔗糖 、葡萄糖 、琼脂粉 、冰乙酸 、乙醇 、乙二胺四乙酸(EDTA) 、十六烷基三乙基溴化

　　1

　　GB/T 29429—2012

　　铵(CTAB) 、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 、十二烷基磺酸钠(SDS) 、液氮 、酚 、三氯甲烷 、异戊醇 、异丙醇 、琼脂糖(电泳 用) 、溴 化 乙 锭 (EB) 、Taq DNA 聚 合 酶 、氯 化 钾 (KCl) 、磷 酸 氢 二 钾 (K2 HPO4 ) 、氯 化 钠 (NaCl) 、磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ) 、氯化镁(MgCl2 ) 、硫酸镁(MgSO4 · 7H2 O) 、硝酸钠(NaNO3 ) 、乙二胺四乙酸钠(Na2EDTA) 、溴 酚 蓝 、蛋 白 酶 K、RNase A、10× PCR 缓 冲 液 、dNTP(dATP、dTTP、dCTP、 dGTP) 。

　　7 检疫鉴定方法

　　7. 1 现场检疫

　　抽样数按 SN/T 1157中规定的方法进行 。

　　在现场检疫时 ,应仔细检查草莓苗叶和茎有无病变症状 ,如在草莓叶面上发现水渍状红褐色不规则形病斑 、叶背溢出菌脓 、植株生长点变黑等可疑症状时 ,应取样作实验室鉴定 。

　　在产地检疫和隔离试种期间 ,还要注意检查有无淡红褐色干枯病叶或生长点死亡的植株 , 当发现可疑症状应取样作实验室鉴定 。

　　7. 2 病原菌分离纯化

　　选取新发病的 、带有水渍状病斑的病叶 ,用 70%的乙醇进行表面消毒 ,切取病健交界处 ,无菌水冲洗后碾碎 ,置于 PBS缓冲溶液(参见附录 B)中 10 min~ 15 min。在无菌操作条件下吸取稀释液均匀涂布于 WILBRINK-N 培养基(参见附录 B)平板上 ,置于 25 ℃培养 5 d~ 7 d,然后再进行三次的纯化 ,最后获得纯菌株 。

　　7. 3 病原菌形态观察及生理生化测定

　　7. 3. 1 形态观察

　　对分离纯化获得的纯菌株 ,经染色制成玻片 ,在显微镜下观察形状 ,测量大小 。

　　7. 3. 2 菌落颜色

　　将菌株在 WILBRINK-N 或 YPGA培养基(参见附录 B)上划线培养 ,置于 25 ℃培养 5 d~ 7 d,观察菌落的颜色和形状 。

　　7. 3. 3 生理生化测定

　　该菌生理生化测定见附录 C。

　　7. 4 致病性测定

　　将 WILBRINK-N 或 YPGA培养液(参见附录 B)中培养 3 d~ 5 d 的菌株 ,用 PBS缓冲溶液稀释到109 CFU/mL,选取完全健康的草莓感病品种 ,用蘸取悬浮液的接种针小心地扎刺新生叶面 , 每片叶扎刺 5~ 10次 ,最好不要扎穿叶子 ,设置五个重复 , 以 PBS缓冲溶液为对照 。接种后用塑料袋罩住植株 ,使植株置于 20 ℃ ~ 25 ℃ 、相对湿度 ≥80%的隔离温室里生长 4 周 ,每天观察并记录发病情况 , 出现症状后 ,用 7. 2方法进行病原菌再分离 、纯化 。

　　7. 5 PCR法检测

　　该检测方法见附录 D。

　　2

　　GB/T 29429—2012

　　8 鉴定特征

　　8. 1 症状特征

　　草莓角斑病菌初侵染时在叶片下表面出现 1 mm~4 mm 大小的水渍状红褐色不规则形病斑 ,病斑扩大时受细小叶脉所限呈角形叶斑 。病斑在可见光下呈透明状 ,在反射光下呈暗绿色 。病斑逐渐扩大后融合成一体 ,渐变淡红褐色而干枯 。湿度大时叶背可见溢出菌脓 ,干燥条件下成一薄膜 。病斑常在叶尖或叶缘处 ,严重时使植株生长点变黑枯死 , 叶片发病后常干缩破碎形成孔洞 。在适宜的条件下 ,花萼也能受侵染 。另外 ,该细菌还可导致维管束病变 。

　　8. 2 病原特征

　　无荚膜杆菌 ,单个 、成双或成短链 ,具单根极鞭 ,革兰氏染色阴性 , 大小约为 0. 4 μm× 1. 3 μm。病菌生长较慢 ,在培养基上 4 d~ 5 d才能形成菌落 。 营养琼脂上 ,菌落圆屋顶形 ,边缘整齐规则 ,有光泽 ,黄色奶油状 。好氧菌 ,氯化钠最大耐受力为 0. 5% ~ 1. 0% ,生长最适温度 25 ℃ ,超过 33 ℃不能生长 。明胶液化 、淀粉水解 ,不水解七叶苷 ,不从阿拉伯糖 、半乳糖 、海藻糖 、纤维二糖溶液产酸 ,不能利用天冬酰胺作唯一碳源和氮源 。

　　8. 3 致病性特征

　　针刺接种后 ,在 7 d左右应出现水渍状红褐色病斑 ,这些病斑逐渐扩大坏死 ,经病原菌再分离获得的纯菌株应具有与原菌株一致的病原特征 。而所设的阴性对照并没有出现相应症状 。

　　8. 4 分子生物学特征

　　测试菌株经 PCR反应后 ,如果 PCR产物与阳性对照条带一致(537bp) ,且阴性对照和空白对照均没有相应条带 ,则能证明所测菌株为阳性 。否则 ,则判断为阴性 。

　　9 结果评定

　　根据草莓角斑病菌的鉴定特征(见第 8章)进行综合判定 ,凡症状 、病原特征 、生理生化特性 、致病性特征以及分子生物学特征与第 8章描述相符 ,可以判定为草莓角斑病菌 ,否则结果判定为不是 。

　　10 样品保存

　　经检疫鉴定后 ,应妥善保存样品及菌株 , 以备复验 、谈判和仲裁 。保存期满 ,需经灭菌后方可处理 。

　　11 菌株保存

　　从检测样品中分离到并鉴定为草莓角斑病菌的菌株 ,应妥善保存 。将菌 株 转 接 到 WILBRINK-N或 YPGA培养基斜面上 ,25 ℃恒温培养 5 d~ 7 d。然后置于 4 ℃冰箱中保存 ,定期(30d~ 60 d)转接 ,防止病菌死亡 ;必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉 , -80 ℃下长期保存 。

　　3

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　草莓角斑病菌的相关资料

　　A. 1 分布

　　以色列 、中国台湾 、比利时 、法国 、希腊 、意大利 、葡萄牙 、罗马尼亚 、西班牙 、瑞士 、埃塞俄比亚 、留尼旺 、澳大利亚 、新西兰 、美国(加利福尼亚州 、佛罗里达州 、肯塔基州 、明尼苏达州 、威斯康星州) 、阿根廷 、巴西 、智利 、厄瓜多尔 、乌拉圭 、委内瑞拉 。

　　A. 2 寄主范围

　　草莓(Fragariaananassa)是该病原菌的主要寄主 。病原菌对草莓属(Fragaria) 的其他品种的致病性变化 较 大 。 人 工 接 种 情 况 下 , 弗 州 草 莓 (F. virginiana) 、野 草 莓 (F. vesca) 、金 露 梅 (Potentilla fruticosa)和 委 陵 菜 (P. glandulosa) 均 可 被 草 莓 角 斑 病 菌 侵 染 。 草 莓 属 植 物 中 仅 麝 香 草 莓 (F. moschata)对草莓角斑病菌免疫 。

　　A. 3 生物学特性

　　病叶残渣和带菌植株是发病的初次侵染源 。在病残叶和土壤中 ,病菌能够存活到下茬作物 ;在实验室保存的干燥病叶片中 ,病原菌至少可存活两年半 。 在草莓开始生长时 ,病原菌由病残叶传播到幼叶上 ,细菌可从侵染区沿着幼叶基部叶脉扩散 ,在田间传播主要靠雨水 、喷灌及风的作用传播 。病原菌可通过气孔侵入 ,也可经过局部伤口或下方的病叶侵染 ,在整个生长期发生多个侵染循环 ,病菌可侵染植物的花 ,但不侵染果实 。 中等偏低的 日温(大约 20℃) 、夜间低温及较高的湿度更有利于该病菌的侵染 。

　　4

　　GB/T 29429—2012

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　草莓角斑病菌常用培养基、缓冲液配方

　　B. 1 WILBRINK-N培养基

　　蔗糖 10. 0 g/L,蛋白胨 5. 0 g/L,磷酸氢二钾 0. 5 g/L,硫酸镁 0. 25 g/L, 硝 酸 钠 0. 25 g/L, 琼 脂15. 0 g/L,pH 7. 2。

　　B. 2 WILBRINK-N培养液

　　蔗糖 10. 0 g/L,蛋白胨 5. 0 g/L,磷酸氢二钾 0. 5 g/L,硫酸镁 0. 25g/L,硝酸钠 0. 25g/L,pH7. 2。

　　B. 3 YPGA培养基

　　葡萄糖 20. 0 g/L,蛋白胨 10. 0 g/L,酵母膏 5. 0 g/L,琼脂 15. 0 g/L,pH 7. 2。

　　B. 4 YPGA培养液

　　葡萄糖 20. 0 g/L,蛋白胨 10. 0 g/L,酵母膏 5. 0 g/L,pH 7. 2。

　　B. 5 PBS缓冲液

　　氯化钠 8. 0 g/L,氯化钾 0. 2 g/L,磷酸氢二钠 2. 9 g/L,磷酸氢二钾 0. 2 g/L,pH 7. 2。

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　　GB/T 29429—2012

　　附 录 C (规范性附录)生理生化测定

　　C. 1 革兰氏染色法

　　按 GB/T 4789. 28—2003中 2. 2规定的方法进行 。

　　C. 2 鞭毛染色法

　　按 GB/T 4789. 28—2003中 2. 7规定的方法进行 。

　　C. 3 草莓角斑病菌与近似种的区别

　　草莓角斑病菌与 近 似 种 草 莓 细 菌 性 叶 斑 病 菌(X. arboricola pv. fragariae) 及 甘 蓝 黑 腐 病 菌(X. campestris)的区别见表 C. 1。

　　表 C. 1 草莓角斑病菌与草莓细菌性叶斑病菌及甘蓝黑腐病菌的区别

　　测试项 目

　　草莓角斑病菌

　　草莓细菌性叶斑病菌

　　甘蓝黑腐病菌

　　35 ℃生长

　　-

　　ND

　　+

　　2%NaCl生长

　　-

　　+

　　+

　　水解七叶苷

　　-

　　+

　　+

　　明胶液化

　　+

　　+

　　±

　　蛋白消化

　　-

　　ND

　　+

　　淀粉水解

　　+

　　+

　　±

　　尿酶产生

　　-

　　-

　　-

　　阿拉伯糖产酸

　　-

　　ND

　　+

　　半乳糖产酸

　　-

　　+

　　+

　　海藻糖产酸

　　-

　　ND

　　+

　　纤维二糖产酸

　　-

　　+

　　+

　　注 : ND未测定; +90%以上菌株为阳性 ; -90%以上菌株为阴性; ±11% ~ 89%菌株为阳性 。

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　　GB/T 29429—2012

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　PCR法检测

　　D. 1 病原细菌 DNA 的提取

　　取待测样品或分离培养菌株 ,利用 DNA提取试剂盒方法提取 DNA,并测定 DNA 浓度 , -20 ℃保存备用 。也可直接用培养的菌株稀释悬浊液作为模板进行 PCR反应 。

　　D. 2 引物序列

　　正向 引 物 : XF9: 5’-TGGGCCATGCCGGTGGAACTGTGTGG-3’; 反 向 引 物 : XF11: 5’-TAC- CCAGCCGTCGCAGACGACCGG-3’。

　　D. 3 PCR反应体系及参数

　　D. 3. 1 PCR反应体系

　　见表 D. 1。

　　表 D. 1 PCR反应体系

　　试剂名称

　　终浓度

　　10×PCR反应缓冲液

　　1×

　　MgCl2

　　2. 5 mmol/L

　　dNTPs

　　0. 2 mmol/L

　　正向引物

　　0. 2 μmol/L

　　反向引物

　　0. 2 μmol/L

　　TaqDNA聚合酶

　　2. 5 U

　　DNA模板

　　1 μL

　　补 H2 O 至

　　50 μL

　　D. 3. 2 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置

　　阴性对照 : 以待测健康的草莓叶片 DNA 为模板 ; 阳性对照 :采用草莓角斑病菌或含有待测基因序列的质粒 ;空白对照 :设两个 ,一是提取 DNA 时设置的提取空白对照(以水代替样品) ,二是 PCR 反应的空白对照(以水代替 DNA模板) 。

　　D. 3. 3 PCR 的反应参数

　　95 ℃/2min;94℃/30s;65 ℃/30s;72 ℃/1 min,35个循环 。72 ℃/5 min,最后 4 ℃保温 。

　　注 : 不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整 。

　　GB/T 29429—2012

　　GB T 29429 2012

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　　D. 3. 4 琼脂糖凝胶电泳

　　制备 2%的琼脂糖凝胶 ,用 DNA Marker作为相对分子质量标记 ,进行电泳分析 , 电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察并拍摄记录 。

　　D. 4 结果判断

　　若有 537bp大小的产物带出现 ,可判定为阳性 。