GB/T 22949-2008 蜂王浆及冻干粉中硝基咪唑类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　ICS 67 . 050 X 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22949—2008

　　蜂王浆及冻干粉中硝基咪唑类药物

　　残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　Determination nitroimidazoleresiduesin royaljelly

　　and lyophilized royaljellyfarina—

　　LC-MS-MS method

　　2008-12-31 发布 2009-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22949—2008

　　前 言

　　本标准的附录 A 、附录 B 为资料性附录 。

　　本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归 口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人：殷居易 、刘永明 、谢东华 、陈杰 、李金 、章再婷 、范春林 、裘定慧 、庞国芳 。

　　Ⅰ

　　GB/T 22949—2008

　　蜂王浆及冻干粉中硝基咪唑类药物

　　残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　1 范围

　　本标准规定了蜂王浆及冻干粉中甲硝唑 、地美硝唑 、替硝唑 、洛硝唑 、特尼哒唑 、异丙硝唑，以及羟基化甲硝唑 、羟基化异丙硝唑 、2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑等 9 种硝基咪唑类药物残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 。

　　本标准适用于蜂产品(蜂王浆 、冻干粉及蜂蜜)中硝基咪唑类药物残留量的测定 。

　　本标准蜂王浆样品的方法检出限：0 . 5 μg/kg 。

　　本标准冻干粉样品的方法检出限：1 . 0 μg/kg 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 。

　　GB/T 6379 . 1 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第 1 部分：总则与定义(GB/T 6379. 1 — 2004 , ISO 5725-1:1994 , IDT)

　　GB/T 6379 . 2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第 2 部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T 6379 . 2—2004 , ISO 5725-2:1994 , IDT)

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682—2008 , ISO 3696:1987 , MOD)

　　3 原理

　　本方法用乙酸钠缓冲液溶解样品基质，乙酸乙酯进行液-液萃取，经过旋转蒸干后，加入四氯化碳和含酸水溶液，离心后取上层溶液，运用液相色谱串联三重四极杆质谱仪(LC-MS-MS)进样检测 。

　　4 试剂和材料

　　除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水 。

　　4 . 1 乙腈：色谱纯 。

　　4 . 2 甲醇：色谱纯 。

　　4 . 3 乙酸乙酯：色谱纯 。

　　4 . 4 甲酸：色谱纯 。

　　4 . 5 四氯化碳 。

　　4 . 6 乙酸钠 。

　　4 . 7 标准品：甲硝唑(metronidazole,缩写 MNZ;CAS:443-48-1) ,地美硝唑(dimetridazole,缩写 DMZ ; CAS:551-92-8) ,替硝唑(tindazole,缩写 TNZ ; CAS : 19387-91-8) ,洛硝唑(ronidazole,缩写 RNZ ; CAS : 7681-76-7) ,特尼哒唑( ternidazole,缩写 TerNDZ),异丙硝唑(ipronidazole,缩写 IPZ) ,羟基化甲硝咪唑(metronidazole-OH ,缩写 MNZ-OH),羟基化异丙硝唑(ipronidazole-OH ,缩写 IPZ-OH) , 2-羟甲基-1-甲基化-5-硝 咪 唑 (2-hydroxymethyl-1-methyl-5-nitro-imidazole , 缩 写 HMMNI) , 以 上 标 准 物 质 纯 度

　　1

　　GB/T 22949—2008

　　≥98% 。 内标物为氘代 2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑( HMMNI-D3 ; CAS: 8061-52-7) ,氘代羟基化异丙硝唑(IPZ-OH-D3 ; CAS: 8061-52-7) ,氘代物质纯度 ≥95% 。

　　4 . 8 标准储备溶液：1 000 μg/mL 。准确称取 10 . 0 mg±0 . 05 mg各标准物质，用甲醇溶解于 10 mL棕色容量瓶中(可放置于超声波清洗器 数 分 钟 促 进 溶 解)，定 容 后 配 成 浓 度 为 1 000 μg/mL 的 标 准 储 备液 。将储备液置于 -20 ℃冰箱中保存备用 。

　　4 . 9 标准中间溶液：100 ng/mL 。可将标准储备溶液(4 . 8) 室温下放置 5 min,使用时用乙腈稀释至所需浓度，临用临配 。

　　4 . 10 乙 酸 钠 缓 冲 溶 液：0 . 1 mol/L 。 准 确 称 取 8 . 204 g 无 水 乙 酸 钠，加 入 5 . 83 mL 冰 乙 酸 定 容 到1 000 mL容量瓶中，超声混合并脱气 15 min后，于液相色谱流动相瓶中备用 。

　　4 . 1 1 甲酸水溶液：0 . 1% 。准确移取 1 mL 甲酸，用水定容到 1 000 mL容量瓶中，超声混合并脱气 15 min后，于液相色谱流动相瓶中备用 。

　　4 . 12 基质混合标准工作液：根据标准物质的灵敏度和仪器线性范围，吸取一定量的中间浓度混合标准液(4 . 9) ,用空白样品提取液配制成系列浓度的基质混合标准工作液 。 临用临配 。

　　4 . 13 滤膜：0 . 2 μm 。

　　5 仪器

　　5 . 1 液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(LC-MS-MS) ：质谱仪配有大气压化学电离源(或与之等效电离源);高效液相色谱配有在线脱气机 、低残留 自动进样器 、可控温柱温箱和高精度混合泵 。

　　5 . 2 电子分析天平：感量 0 . 1 mg 和 10 mg 。

　　5 . 3 冷冻离心机：速度可达 4 000 r/min 和 13 000 r/min 。

　　5 . 4 氮吹仪：水浴和加热控温 。

　　5 . 5 台式分散仪 。

　　5 . 6 旋转浓缩仪：带真空蒸发和循环冷却水 。

　　5 . 7 超纯水器 。

　　5 . 8 超声波清洗器 。

　　5 . 9 多功能食品粉碎机 。

　　5 . 10 旋涡混合仪 。

　　5 . 1 1 鸡心瓶：125 mL 。

　　5 . 12 离心管：15 mL 和 50 mL;聚四氟乙烯材质 。

　　5 . 13 容量瓶：10 mL 和 1 000 mL 。

　　6 试样的制备与保存

　　6 . 1 试样的制备

　　将液体 、浆状 、粉状的样品充分混合均匀;将低温保存的固体样品进行粉碎磨细后供检测 。必要时将实验室样品用四分法进行缩分 。

　　根据样品的性状和保存要求将样品保存在适当的环境中避免变质 。

　　6 . 2 试样的保存

　　将试样于 -20 ℃冰箱中保存备用 。

　　7 测定步骤

　　7 . 1 提取

　　称取约 2 . 5 g ~ 5 . 0 g试样(蜂王浆称量 5 . 0 g±0 . 2 g;冻干粉称量 2 . 5 g±0 . 2 g) 于 50 mL 离心管中，分别添加氘代标示物 HMMNI-D3 、IPZ-OH-D3 (4 . 7) 100 μL,加入 20 mL 乙酸钠缓冲溶液(4 . 10) 充

　　2

　　GB/T 22949—2008

　　分涡旋振荡提取1 min 。

　　再加入 20 mL 乙酸乙酯，经过涡旋 、液-液萃取，将乙酸乙酯层全部移入鸡心旋蒸瓶，重复上述操作，合并三次乙酸乙酯提取液于鸡心旋蒸瓶，在 40 ℃以下浓缩近干，除去溶剂 。

　　7 . 2 净化

　　鸡心旋蒸瓶残渣用 1 mL 四氯化碳和 1 mL 甲酸水溶液(4 . 11) 溶解，充分涡旋 1 min 。 吸取上层水溶液，用微孔过滤膜(0 . 2 μm)过滤，此为试验溶液 。

　　7 . 3 色谱测定

　　7 . 3 . 1 液相色谱参考条件

　　a) 色谱柱：Waters Sunfire ODS C18 , 5 μm , 250 mm×4 . 6 mm(内径)或相当者;

　　b) 柱温：30 ℃ ;

　　c) 流动相：0 . 1%甲酸水溶液;液相梯度见表 1 ;

　　d) 流速：800 μL/min ;

　　e) 进样量：10 μL 。

　　表 1 液相色谱流动相梯度表

　　时间/min

　　流动相 A(甲酸水溶液)/%

　　流动相 B(乙腈溶液)/%

　　流速/(μL/min)

　　0 . 00

　　95

　　5

　　800

　　2 . 00

　　95

　　5

　　800

　　6 . 00

　　65

　　35

　　800

　　12 . 00

　　10

　　90

　　800

　　14 . 00

　　10

　　90

　　800

　　15 . 00

　　95

　　5

　　800

　　20 . 00

　　95

　　5

　　800

　　7 . 3 . 2 质谱参考条件

　　a) 离子源：大气压化学电离源(或与之等效电离源);

　　b) 扫描方式：正离子扫描;

　　c) 检测方式：多反应离子监测( MRM) ;

　　d) 电喷雾电压(IS) : 5 250 V ;

　　e) 雾化气(NEB)相对开放流量：14 . 00 mL/min ;

　　f) 气帘气(CUR)相对开放流量：7 . 00 mL/min ;

　　g) 离子源温度(TEM) : 500 ℃ ;

　　h) 碰撞池出 口 电压(CXP) : 11 V ;

　　i) 选择离子驻留时间(Dwell) : 50 ms ;

　　j) 碰撞池入 口 电压(EP) : 10 . 0 V ;

　　k) 碰撞气(CAD)相对开放流量：8 mL/min ;

　　l) 辅助气流压力：413 . 8 kPa ;

　　m) 去簇电压(DP) : 35 V ;

　　n) 焦环聚焦电压(FP) : 200 V ;

　　o) 喷雾器放电针电流(NC) : 2 μA ;

　　p) 检测器参数(正 离 子 化 模 式)，离 子 流 转 向电 压(DF) : - 200 . 0 V;检 测 器 脉 冲 信 号 增 强 电 压(CEM) : 2 300 . 0 V ;

　　q) 定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量 、色谱峰保留时间见表 2 。

　　3

　　GB/T 22949—2008

　　表 2 硝基咪唑类药物中英文名称 、定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量 、色谱峰保留时间

　　化合物中文名称

　　化合物英文名称

　　定性离子对(m/≈)

　　定量离子对(m/≈)

　　碰撞气能量(CE)/V

　　色谱峰保留时间/min

　　羟基化甲硝咪唑

　　metronidazole-OH缩写：MNZ-OH

　　188 . 0/125 . 9

　　188 . 0/144 . 0

　　188 . 0/125 . 9

　　25

　　20

　　9 . 01

　　甲硝唑

　　metronidazole缩写：MNZ

　　172 . 0/128 . 0

　　172 . 0/82 . 10

　　172 . 0/128 . 0

　　22

　　35

　　9 . 48

　　2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑

　　2-hydroxymethyl-1-methyl- 5-nitro-imidazole

　　缩写：HMMNI

　　158 . 0/140 . 0

　　158 . 0/55 . 1

　　158 . 0/140 . 0

　　20

　　33

　　9 . 67

　　氘代 2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑

　　D3 -2-Hydroxymethyl-1 - methyl-5-nitro-imidazole缩写：HMMNI-D3

　　161 . 0/143 . 1

　　161 . 0/58 . 0

　　161 . 0/143 . 1

　　24

　　32

　　9 . 63

　　特尼哒唑

　　ternidazole

　　缩写：TerNDZ

　　186 . 0/128 . 1

　　186 . 0/82 . 2

　　186 . 0/128 . 1

　　24

　　40

　　9 . 90

　　洛硝唑

　　ronidazole缩写：RNZ

　　201 . 0/140 . 0

　　201 . 0/110 . 0

　　201 . 0/140 . 0

　　18

　　25

　　10 . 21

　　地美硝唑

　　dimetridazole缩写：DMZ

　　142 . 0/96 . 1

　　142 . 0/81 . 1

　　142 . 0/96 . 1

　　25

　　37

　　10 . 32

　　替硝唑

　　tindazole缩写：TNZ

　　248 . 0/121 . 0

　　248 . 0/93 . 1

　　248 . 0/121 . 0

　　25

　　28

　　11 . 06

　　羟基化异丙硝唑

　　ipronidazole-OH缩写：IPZ-OH

　　186 . 0/168 . 0

　　186 . 0/122 . 1

　　186 . 0/168 . 0

　　20

　　28

　　11 . 40

　　氘代羟基化异丙硝唑

　　D3 -Ipronidazole-OH缩写：IPZ-OH-D3

　　189 . 0/171 . 0

　　189 . 0/125 . 0

　　189 . 0/171 . 0

　　25

　　35

　　11 . 40

　　异丙硝唑

　　ipronidazole缩写：IPZ

　　170 . 0/124 . 1

　　170 . 0/109 . 1

　　170 . 0/124 . 1

　　25

　　35

　　12 . 79

　　7 . 3 . 3 液相色谱-串联三重四极杆质谱测定

　　7 . 3 . 3 . 1 定性测定

　　被测组分选择 1 个母离子，2 个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物保留时间与标准溶液中保留时间偏差在 ±2 . 5%之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰 度 进 行 比 较，若 偏 差 不 超 过 表 3 规 定 的 范 围，则 可 判 断 为 样 品中 存 在 对 应 的 待测物 。

　　表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示

　　相对离子丰度 K

　　K>50

　　20

　　10

　　K≤10

　　允许的最大偏差

　　± 20

　　± 25

　　± 30

　　± 50

　　7 . 3 . 3 . 2 定量测定

　　在仪器正常工作条件下，对基质混合标准工作溶液(4 . 12)进样，以标准溶液中被测组分峰面积为纵坐标，标准溶液中被测组分浓度为横坐标绘制工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中

　　4

　　GB/T 22949—2008

　　待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，超过线性范围则应适当稀释后再进行分析 。方法采用外标法定量 。9 种硝基咪唑类药物和 2 种氘代内标物的多反应监测( MRM)色谱图参见附录 A 图 A. 1 。各分析物质的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录 B 中表 B. 1 和表 B. 2 。

　　7 . 4 平行试验

　　按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定 。

　　7 . 5 回收率试验

　　阴性样品中添加标准溶液，按 7 . 1 和 7 . 2 操作，测定后计算样品添加的回收率 。

　　8 结果计算

　　蜂王浆及冻干粉中甲硝唑 、地美硝唑 、替硝唑 、洛硝唑 、特尼哒唑 、异丙硝唑，以及羟基化甲硝唑 、羟基化异丙硝唑 、2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑等 9 种硝基咪唑类药物残留量的测定结果按式(1)计算：

　　X = c

　　式中：

　　X— 试样中被测物残留量，单位为微克每千克(μg/kg) ;

　　cs — 基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　A— 试样溶液中被测物的色谱峰面积;

　　As — 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积;

　　ci— 试样溶液中内标物的浓度，单位纳克每毫升(ng/mL) ;

　　csi— 基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　Asi— 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积;

　　Ai— 试样溶液中内标物的色谱峰面积;

　　V— 样液最终定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　m— 试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g) 。

　　计算结果应扣除空白值 。

　　9 精密度

　　9 . 1 一般规定

　　本标准的精密度数据是按照 GB/T 6379 . 1 和 GB/T 6379 . 2 的规定确定的，重复性和再现性的值以 95%的可信度来计算 。

　　9 . 2 重复性

　　在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对值不超过重复性限 r，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表 4 和表 5 。

　　表 4 蜂王浆样品基质添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克

　　化合物名称

　　添加浓度范围

　　重复性限 r

　　再现性限 R

　　羟基化甲硝咪唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 957 0lgm-0 . 817 6

　　lgR= 0 . 711 5lgm-0 . 582 9

　　甲硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 1 . 092 2lgm-0 . 864 8

　　lgR= 0 . 722 5lgm-0 . 626 3

　　2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 993 0lgm-0 . 774 2

　　lgR= 0 . 644 4lgm-0 . 547 1

　　特尼哒唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 906 7lgm-0 . 698 9

　　lgR= 0 . 661 9lgm-0 . 503 9

　　洛硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 981 4lgm-0 . 768 2

　　lgR= 0 . 600 1lgm-0 . 500 9

　　地美硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 1 . 107 2lgm-0 . 860 6

　　lgR= 0 . 742 5lgm-0 . 563 2

　　5

　　GB/T 22949—2008

　　表 4(续) 单位为微克每千克

　　化合物名称

　　添加浓度范围

　　重复性限 r

　　再现性限 R

　　替硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 989 4lgm-0 . 764 6

　　lgR= 0 . 926 1lgm-0 . 591 7

　　羟基化异丙硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 899 1lgm-0 . 796 8

　　lgR= 0 . 480 5lgm-0 . 497 8

　　异丙硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 1 . 105 7lgm-0 . 866 6

　　lgR= 0 . 686 1lgm-0 . 566 8

　　注：m为两次测定值的平均值 。

　　表 5 冻干粉样品基质添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克

　　化合物名称

　　添加浓度范围

　　重复性限 r

　　再现性限 R

　　羟基化甲硝咪唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 1 . 242 6lgm-0 . 956 4

　　lgR= 0 . 764 2lgm-0 . 594 0

　　甲硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 989 5lgm-0 . 926 2

　　lgR= 0 . 704 2lgm-0 . 597 0

　　2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 1 . 087 7lgm-0 . 987 3

　　lgR= 0 . 737 8lgm-0 . 647 9

　　特尼哒唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 1 . 027 6lgm-0 . 814 9

　　lgR= 0 . 669 8lgm-0 . 586 6

　　洛硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 921 5lgm-0 . 999 4

　　lgR= 0 . 736 5lgm-0 . 654 6

　　地美硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 874 2lgm-0 . 926 7

　　lgR= 0 . 404 2lgm-0 . 580 5

　　替硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 905 9lgm-0 . 860 6

　　lgR= 0 . 625 0lgm-0 . 609 7

　　羟基化异丙硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 833 2lgm-0 . 866 8

　　lgR= 0 . 624 0lgm-0 . 649 9

　　异丙硝唑

　　0 . 5 ~ 25 . 0

　　lgr= 0 . 464 2lgm-0 . 812 6

　　lgR= 0 . 160 5lgm-0 . 611 6

　　注：m为两次测定值的平均值 。

　　如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 。

　　9 . 3 再现性

　　在再现性试验条件下，获得的两次独立测试的结果的绝对差值不超过再现性限 R，被测物的含量范围及再现性方程见表 4 和表 5 。

　　6

　　GB/T 22949—2008

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　多反应监测(MRM)色谱图

　　9 种硝基咪唑类药物和 2 种氘代内标物的多反应监测色谱图见图 A. 1 。

　　7

　　1 — 羟基化甲硝咪唑;

　　2 — 甲硝唑;

　　3 — 2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑;

　　4 — 氘代 2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑;

　　

　　5 — 特尼哒唑;

　　6 — 洛硝唑;

　　7 — 地美硝唑;

　　8 — 替硝唑;

　　

　　9 — 羟基化异丙硝唑;

　　10 — 氘代羟基化异丙硝唑;

　　11 — 异丙硝唑 。

　　图 A.1 9 种硝基咪唑类药物和 2 种氘代内标物的多反应监测色谱图

　　GB/T 22949—2008

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　回 收 率

　　9 种硝基咪唑类药物甲硝唑 、地美硝唑 、替硝唑 、洛硝唑 、特尼哒唑 、异丙硝唑 、羟基化甲硝唑 、羟基化异丙硝唑 、2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑在蜂王浆 、冻干粉基质中的添加浓度及其平均回收率的实验室内试验数据，见表 B. 1 、表 B. 2 。

　　表 B.1 蜂王浆样品基质中 9 种硝基咪唑类药物的添加浓度和平均回收率试验数据

　　化合物名称

　　添加浓度/(μg/kg)

　　平均回收率/%

　　羟基化甲硝咪唑

　　0 . 5

　　73 . 6

　　1 . 0

　　82 . 9

　　2 . 0

　　91 . 9

　　甲硝唑

　　0 . 5

　　88 . 9

　　1 . 0

　　92 . 4

　　2 . 0