GB/T 22916-2008 水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法

　　ICS 1 1 . 220 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22916—2008

　　水泡性口炎病毒荧光 RT-PCR检测方法

　　ProtocoloffluorogenicRT-PCR forvesicularstomatitisvirus

　　2008-12-31 发布 2009-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22916—2008

　　前 言

　　本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物 、禽鸟与蜜蜂)》 (第 5 版)。

　　本标准的附录 A 为规范性附录，附录 B 为资料性附录 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归 口 。

　　本标准起草单位：中 华 人 民 共 和 国 深 圳 出 入 境 检 验 检 疫 局 、中 华 人 民 共 和 国 云 南 出 入 境 检 验 检疫局 。

　　本标准主要起草人：花群义 、周晓黎 、曾少灵 、曹琛福 、詹爱军 、张彩虹 、林庆燕 、陈兵 、杨云庆 、孙洁 。

　　Ⅰ

　　GB/T 22916—2008

　　水泡性口炎病毒荧光 RT-PCR检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了水泡性口炎病毒荧光 RT-PCR 检测的操作方法 。

　　本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测 。

　　2 缩略语

　　下列缩略语适用于本标准 。

　　2 . 1 荧光 RT-PCR

　　荧光反转录-聚合酶链反应 。

　　2 . 2 ct值

　　每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。

　　2 . 3 RNA

　　核糖核酸 。

　　2 . 4 DEPC

　　焦碳酸磷酯 。

　　2 . 5 PBS

　　磷酸盐缓冲盐水(配方见附录 A) 。

　　2 . 6 Taq 酶

　　TaqDNA 聚合酶 。

　　2 . 7 VSV

　　水泡性口炎病毒 。

　　3 原理

　　水泡性口炎病毒属 RNA病毒，根据水泡性口炎病毒两型共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针 。通过严格设计和筛选的引物和探针，涵盖水泡性口炎病毒的两个型和突变株，为水泡性口炎病毒的特异性通用引物和探针 。探针的 5 ′端标记 FAM 荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团;3 ′端标记 TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收 5 ′端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团 。在扩增时，Taq酶发挥它的 5 ′→ 3 ′端外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，消除阻碍，标记在探针两端的报告荧光基团和淬灭荧光基团均游离于溶液中，仪器检测到发出的荧光信号 。

　　4 材料与试剂

　　4 . 1 仪器与器材

　　4 . 1 . 1 荧光 RT-PCR 检测仪 。

　　4 . 1 . 2 高速台式冷冻离心机(离心速度 12 000 r/min 以上)。

　　4 . 1 . 3 台式离心机(离心速度 3 000 r/min) 。

　　4 . 1 . 4 混匀器 。

　　4 . 1 . 5 冰箱(2 ℃ ~ 8 ℃和-20 ℃两种)。

　　4 . 1 . 6 微量可调移液器(5 μL , 10 μL , 100 μL , 1 000 μL )及配套带滤芯吸头 。

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　　GB/T 22916—2008

　　4 . 1 . 7 Eppendorf 管(1 . 5 mL) 、透明薄壁 PCR 管(0 . 2 mL) 。

　　4 . 2 试剂

　　4 . 2 . 1 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无 RNA 酶污染的容器(用 DEPC水处理后高压灭菌)分装 。

　　4 . 2 . 2 三氯甲烷 。

　　4 . 2 . 3 异丙醇：-20 ℃预冷 。

　　4 . 2 . 4 PBS：配方见附录 A 。

　　4 . 2 . 5 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和 DEPC水配制，-20 ℃预冷 。

　　4 . 2 . 6 水泡性口炎病毒荧光 RT-PCR检测试剂盒：组成 、功能及使用注意事项参见附录 B 。

　　4 . 2 . 7 引 物：上 游 引 物 为 5 ′-ATGGCTCCTACAGTTAAGAGAATCA-3 ′, 下 游 引 物 为 5 ′-TGAAG- TAATCAGCCGGGTATTC-3 ′。

　　4 . 2 . 8 荧 光 双 标 记 探 针(10 μmol/L) : (FAM) 5 ′-CGAAATTACCGGCCA ACGAGGATC-3 ′(TAM- AR) 。扩增 目标片段长度为 97 bp 。

　　5 抽样

　　5 . 1 采样工具

　　5 . 1 . 1 下列采样工具应经 121 ℃ ±2 ℃ , 15 min 高压灭菌并烘干 。

　　5 . 1 . 2 棉拭子 。

　　5 . 1 . 3 剪刀 、镊子 。

　　5 . 1 . 4 注射器 。

　　5 . 1 . 5 1 . 5 mL Eppendorf管 。

　　5 . 1 . 6 研钵 。

　　5 . 2 样品采集

　　5 . 2 . 1 采集的样品主要是口腔 、蹄冠上的水泡上皮组织 、水泡液 、血液 、口腔分泌物和组织 。采集后立即冷藏送检或放入含抗生素的 PBS缓冲液中于 4 ℃环境中保藏 。编号并作好记录 。

　　5 . 2 . 2 水泡液及水泡皮：只有当水泡完整时才能采集到水泡液 。水泡一旦出现很快就会破溃，所以要不失时机地采集水泡液 。首先用 75%酒精轻轻消毒水泡表皮，尽量去掉污物，用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素的 PBS缓冲液灭菌瓶中 。

　　5 . 2 . 3 水泡液采取后，将水泡皮以无菌术剪下，放入含抗生素的 PBS 缓冲液中 。若水泡已经破溃，则只能采集破溃的水泡皮，用灭菌生理盐水涮洗掉水泡皮上的污物，放入上述缓冲液中 。

　　5 . 2 . 4 口腔分泌物和咽喉拭子：用拭子采取口腔分泌物或将拭子深入口腔内来回刮 3 次 ~ 5 次取分泌液，拭子一并放入盛有 1 . 0 mL含抗生素的 PBS缓冲液的 1 . 5 mL Eppendorf管中 。也可用食道探杯刮取咽喉液体，放入加有抗生素的 PBS 中 。编号，冷藏送检或低温保藏 。

　　5 . 2 . 5 血液：用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌 Eppendorf管中，密封 、编号后保存于 4 ℃环境中送检 。

　　5 . 2 . 6 肌肉或组织脏器：无菌采集待检样品，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，冷藏送检或低温保藏 。

　　5 . 3 样品贮运

　　样品采集后，放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放入一个塑料袋内)，于保温箱中加冰 、密封，送实验室 。

　　5 . 4 样品制备

　　5 . 4 . 1 水泡液 、口腔分泌物 、血液和精液

　　样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置 30 min,取上清液转

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　　入无菌的 1 . 5 mL Eppendorf管中，编号备用 。

　　5 . 4 . 2 水泡皮 、肌肉或组织脏器

　　取待检样品 2 . 0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加 10 mL PBS 混匀，4 ℃下以 3 000 r/min离心 15 min,取上清液转入无菌的 1 . 5 mL Eppendorf管中，编号备用 。

　　5 . 5 样本存放

　　制备的样本在 2 ℃ ~ 8 ℃条件下保存应不超过 24 h , 若需长期保存应置于- 70 ℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过三次)。

　　6 操作方法

　　6 . 1 实验室要求

　　水泡性口炎病毒荧光 RT-PCR 检测的实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区 、反应混合物配制区和检测区;各工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备 、物品混用;每一区域应有专用的仪器设备;进入各个工作区域应严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区 、扩增反应混合物配制区至检测区 。

　　6 . 2 样本的处理

　　6 . 2 . 1 在样本制备区进行 。样品中总 RNA 提取的试剂盒，有商品化试剂盒出售，也可自行配制 。

　　6 . 2 . 2 取 n个灭菌的 1 . 5 mL Eppendorf管，其中 n 为被检样品 、阳性对照与阴性对照的数量之和(阳性对照 、阴性对照在试剂盒中已标出)，编号 。

　　6 . 2 . 3 每管加入 600 μL裂解液，分别加入被检样本 、阴性对照 、阳性对照各 200 μL , 一份样本换用 一个吸头，再加入 200 μL 三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀 5 s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。 于 4 ℃以 12 000 r/min 离心 15 min 。

　　6 . 2 . 4 取与 6 . 2 . 2 相同数量灭菌的 1 . 5 mL Eppendorf管，加入 500 μL异丙醇( -20 ℃预冷)，做标记 。吸取 6 . 2 . 3 各 管 中 的 上 清 液 转 移 至 相 应 的 管 中，上 清 液 应 至 少 吸 取 500 μL, 不 能 吸 出中 间 层，颠 倒混匀 。

　　6 . 2 . 5 于 4 ℃ 、以 12 000 r/min 离心 15 min(Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干);加入 600 μL 75%乙醇，颠倒洗涤 。

　　6 . 2 . 6 于 4 ℃ 、以 12 000 r/min 离心 10 min(Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。

　　6 . 2 . 7 以 4 000 r/min 离心 10 s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥 3 min,不能过于干燥，以免 RNA不溶 。

　　6 . 2 . 8 各管加入 11 μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA,以 2 000 r/min 离心 5 s,冰上保存备用 。提取的 RNA应在 2 h 内进行 PCR扩增;若需长期保存应放置于- 70 ℃冰箱内 。

　　6 . 3 检测

　　6 . 3 . 1 扩增试剂准备

　　在反应混合物配制区进行 。从试剂盒中取出相应的荧光 RT-PCR 反应液 、Taq酶，在室温下融化后，以 2 000 r/min 离心 5 s 。设所需荧光 RT-PCR 检测总数为n(n=u+2+1) , 其中u 为被检样品数 、2为阳性对照数 、1 为阴性对照数，每个样品测试反应体系配制见表 1 。

　　3

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　　表 1 反应体系混合液的配制

　　序号

　　组 分

　　每管用量/μL

　　n管总用量/μL

　　1

　　荧光 RT-PCR反应液(2×)

　　25

　　n×25

　　2

　　Taq酶

　　1

　　n×1

　　3

　　RT-PCR反转录酶颗粒

　　1/2(颗)

　　n×1/2(颗)

　　4

　　RNA酶抑制剂(RNasin)

　　1

　　n×1

　　5

　　ROX参考染料

　　(ROX reference dye)

　　1

　　n×1

　　6

　　DEPC水

　　12 μL

　　n×12

　　6 . 3 . 2 反应体系混合液分装

　　根据测试样品的总数(n)，计算好各试剂的使用量，加入到适当体积的试管中，向其中加入 n×1/2 (颗)RT-PCR反转录酶颗粒，充分混合均匀，向每个 PCR 管中各分装 40μL,转移至样本处理区 。

　　6 . 3 . 3 加样

　　在样本处理区进行 。在各设定的 PCR 管中分别加入 6 . 2 . 8 中制备的 RNA溶液 10 μL,盖紧管盖，以 500 r/min 离心 30 s 。将 PCR 管放于 96 孔板上，一定要按顺序记录好被检样品管 、阳性对照管 、阴性对照管，转移至检测区 。

　　6 . 3 . 4 荧光 RT-PCR检测

　　6 . 3 . 4 . 1 在检测区进行 。将 6 . 3 . 2 中离心后的 PCR 管放入荧光 RT-PCR 检测仪内，记录样本摆放顺序 。在 96 孔板内(表内)记录或填写被检样品(Unknown) 、阳性对照(PC) 、阴性对照(NTC) 。设置探针：5 ′为 FAM , 3 ′为 TAMAR 。

　　6 . 3 . 4 . 2 循环条件设置：

　　— 第一阶段，反转录 42 ℃/30 min ;

　　— 第二阶段，预变性 92 ℃/3 min ;

　　— 第三阶段，92 ℃/10 s, 45 ℃/30 s , 72 ℃/1 min , 5 个循环;

　　— 第四阶段，92 ℃/10 s , 60 ℃/30 s, 40 个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光 。

　　试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和 ct值判定结果 。

　　7 结果判定

　　7 . 1 结果分析条件设定

　　直接读取检测结果 。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准 。

　　7 . 2 质控标准

　　7 . 2 . 1 阴性对照无 ct值，并且无扩增曲线，一直为水平线 。

　　7 . 2 . 2 阳性对照的 ct值应小于 28 . 0 ,并出现典型的扩增曲线，2 个阳性对照扩增曲线基本重合，否则，此次实验视为无效 。

　　7 . 3 结果描述及判定

　　7 . 3 . 1 阴性

　　无 ct值并且无扩增曲线，表示样品中无水泡性口炎病毒 。

　　7 . 3 . 2 阳性

　　ct值小于等于 30 . 0 ,且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在水泡性口炎病毒 。

　　7 . 3 . 3 有效原则

　　ct值在 30 . 0 ~ 35 . 5 的样本建议重做 。重做结果无 ct值或大于 35 . 0 者为阴性，否则为阳性 。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　试剂的配制

　　A.1 A 液

　　0 . 2 mol/L磷酸二氢钠水溶液：磷酸二氢钠(NaH2 PO4 · H2 O) 27 . 6 g,溶于蒸馏水中，最后稀释至1 000 mL 。

　　A.2 B 液

　　0 . 2 mol/L 磷 酸 氢 二 钠 水 溶 液：磷 酸 氢 二 钠 (Na2 HPO4 · 7H2 O) 53 . 6 g(或 Na2 HPO4 · 12H2 O 71 . 6 g , 或 Na2 HPO4 ·2H2 O 35 . 6 g),加蒸馏水溶解，最后稀释至 1 000 mL 。

　　A.3 0 . 0 1 mol/L、PH7 . 2 磷酸盐缓冲盐水(PBS)的配制

　　取 A 液 14 mL , B 液 36 mL,加氯化钠(NaCl) 8 . 5 g,用蒸馏水稀释至 1 000 mL 。 经 121 ℃ 15 min高压灭菌，冷却后，无菌条件下按每毫升加入 1 000 IU青霉素 、1 000 μg链霉素 。

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　　附 录 B (资料性附录)试剂盒的组成

　　B.1 试剂盒组成

　　每个试剂盒可做 48 个检测，包括以下成分：

　　裂解液

　　30 mL×1 盒

　　DEPC水

　　2 mL×1 管

　　RT-PCR反应液(内含水泡性口炎病毒的引物 、探针)

　　750 μL×1 管

　　RT-PCR 酶

　　2 颗粒 × 12 管

　　Taq酶

　　12 μL×1 管

　　阴性对照

　　1 mL×1 管

　　阳性对照(非感染性体外转录 RNA)

　　2 mL×1 管

　　ROX参考染料(ROX reference dye)

　　0 . 1 mL×1 管

　　B.2 说明

　　B.2 . 1 裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为 RNA 提取试剂，外观为红色液体，于 4 ℃保存 。

　　B.2 . 2 DEPC水是用 1%DEPC处理后的去离子水，用于溶解 RNA 。

　　B.2 . 3 RT-PCR 反应液中含有特异性引物 、探针及各种离子 。

　　B.3 功能

　　试剂盒可用于动物组织样品(包括水泡皮 、水泡液 、组织 、脏器 、分泌物 、血液等)中水泡性口炎病毒的检测 。

　　B.4 使用时的注意事项

　　B.4 . 1 在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染 。

　　B.4 . 2 反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器 。

　　B.4 . 3 RT-PCR 酶颗粒极易吸潮失活，应在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中 。

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