GB/T 21459.1-2008 真菌农药母药产品标准编写规范

　　ICS 65. 100 . 0 1 G 23

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21459. 1—2008

　　真菌农药母药产品标准编写规范

　　Specification guidelines

　　for fungalpesticidetechnicalconcentrates(TK)

　　2008-02-14 发布 2008-08-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21459 . 1—2008

　　前 言

　　GB/T 21459 分为五个部分：

　　—GB/T 21459 . 1—2008 真菌农药母药产品标准编写规范;

　　—GB/T 21459 . 2—2008 真菌农药粉剂产品标准编写规范;

　　—GB/T 21459 . 3—2008 真菌农药可湿性粉剂产品标准编写规范;

　　—GB/T 21459 . 4—2008 真菌农药油悬浮剂产品标准编写规范;

　　—GB/T 21459 . 5—2008 真菌农药饵剂产品标准编写规范 。

　　本部分为 GB/T 21459 的第 1 部分 。

　　本部分的附录 A 为规范性附录，附录 B 为资料性附录 。

　　本部分由中华人民共和国农业部提出并归 口 。

　　本部分起草单位：农业部农药检定所 、中国农业科学院植物保护研究所 。

　　本部分主要起草人：农向群 、王以燕 、张泽华 、顾宝根 、刘绍仁 、李宝玉 、高松 、陈景芬 、张礼生 。

　　本部分首次发布 。

　　Ⅰ

　　GB/T 21459 . 1—2008

　　引 言

　　微生物农药是生物农药中的一类，包括细菌 、真菌 、病毒和原生动物等天然的或经人工诱变处理及基因修饰的微生物，通过人工繁殖和加工而成的用于防治病 、虫 、草 、鼠等有害生物的制剂 。真菌农药是微生物农药的一种，其有效成分是相关靶标生物的病原真菌活菌体 。 菌体形态主要有孢子(如分生孢子 、芽生孢子 、休眠孢子等)和菌丝体等 。 分生孢子是一种无性繁殖细胞，为真菌农药中通常存在的形态，并作为有效成分基本单元 。

　　真菌农药母药是指由真菌纯菌种经生物发酵获得单一形态或组合形态的高含量的真菌活菌体制剂，并包含伴随发酵过程的相关生物组分和(或)少量化学杂质的产品 。 目前广泛应用的大多是以分生孢子为活性成分的杀虫类真菌制剂，据不完全统计，在全球已登记注册的有 7 属 10 余种的 50 多个产品，产品类型多数为粉剂，少数为油悬浮剂及其他剂型 。 目前国际组织中尚未有真菌农药母药标准的通用编写规范 。本部分是在参考了联合国粮农组织(FAO) 、世界卫生组织( WHO) 联合发布的 2002 年第一版《PESTICIDE SPECIFICATIONS》(农药标准)第九章中的细菌农药标准和 HG/T 2467 . 8—2003 《农药母药产品标准编写规范》及其他相关标准的基础上制定的，在规定技术指标的内容和检测方法时充分考虑了真菌的生物特性和当前真菌农药生产的技术水平 。本部分是以分生孢子为活性成分的杀虫真菌母药为基准制定，对具有其他功能的或非分生孢子形态的真菌农药可作相应调整 。

　　Ⅱ

　　GB/T 21459 . 1—2008

　　真菌农药母药产品标准编写规范

　　1 范围

　　GB/T 21459 的本部分规定了真菌农药母药产品标准中的产品要求 、试验方法以及标志 、标签 、包装 、贮存和运输等规范性技术要素的内容和编写要求 。

　　本部分适用于真菌农药母药产品的国家标准 、行业标准或企业标准的编写 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过 GB/T 21459 的本部分的引用而成为本部分的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否 可 使 用 这 些 文 件 的 最 新 版 本 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本 适 用 于 本部分 。

　　GB/T 191 包装储运图示标志(GB/T 191—2000 , eqv ISO 780:1997)

　　GB/T 1250 极限数值的表示方法和判定方法

　　GB/T 1601 农药 pH 值的测定方法

　　GB/T 1604 商品农药验收规则

　　GB/T 1605 商品农药采样方法

　　GB 3796 农药包装通则

　　GB/T 16150 农药粉剂 、可湿性粉剂细度测定方法

　　HG/T 2467 . 8—2003 农药母药产品标准编写规范

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于 GB/T 21459 的本部分 。

　　3 . 1

　　真菌农药母药 fungalpesticidetechnicalconcentrate(TK)

　　由相关靶标生物的病原真菌的纯菌种经生物发酵生产而获得的高含量的单一或组合形态的活菌体母药，通常情况下还会包含伴随发酵过程的相关生物组分和少量化学杂质 。

　　3 . 2

　　孢子 spore

　　真菌的繁殖体，有多种类型 。

　　3 . 3

　　分生孢子 conidium

　　真菌的一种无性繁殖细胞，由分生孢子梗上产孢细胞产生，是真菌农药中最常见的形态 。

　　3 . 4

　　含菌量 fungaldensity

　　真菌农药的单位质量中所含有效成分真菌的数量 。

　　3 . 5

　　含孢量 sporedensity

　　形态为孢子的真菌农药的单位质量中所含有效成分真菌孢子的数量 。

　　1

　　GB/T 21459 . 1—2008

　　3 . 6

　　活菌率 fungalviability

　　真菌农药的有效成分真菌中可萌发生长的菌量占该菌总量的百分率 。

　　3 . 7

　　杂菌率 microbialcontaminant

　　真菌农药中除了有效成分真菌外，其他菌(真菌和细菌等)量占总菌量的百分率 。

　　3 . 8

　　毒力 virulence

　　真菌农药对靶标有害生物(虫 、螨 、菌 、草 、鼠等)的致死或抑制能力 。 以通过活体生物测定得到的致死中量 LD50 、致死中时 LT50 、抑制率等表示 。

　　3 . 9

　　贮存稳定性 storage stability

　　在一般室温和(或)低于室温下贮存一定时间后，产品的活菌率与其标明值的相对百分率 。

　　3 . 10

　　热贮稳定性 stability atelevated temperature

　　在高于一般室温下贮存较短时间后，产品的活菌率与其标明值的相对百分率 。一般是在没有取得贮存稳定性数据时，为了帮助加快检测贮存稳定性而进行的先行估计值 。

　　4 要求

　　4 . 1 有效成分描述

　　应提供真菌农药母药有效成分的名称和基本生化参数等信息，并写在标题之后 、范围之前 。

　　所提供的信息应包括菌种中文通用名及其别名，菌种拉丁文学名及其异名，菌种来源 、株系分型或代码，菌种生物学分类地位及其鉴定特征等 。鉴定特征可以是形态学 、生物化学或遗传学特征，应尽可能提供从国际公认机构能得到的鉴定特征的参考文献 。如果使用基因修饰过的菌株，还应陈述相关信息，对有特定基因序列的应指出登记号 。还应标明菌种保藏机构及登记号或编号，母药中有效成分的主要存在形态 、生物活性即防治对象，以及菌种保存条件 、适宜生长条件等参数(格式见附录 A) 。

　　4 . 2 组成和外观

　　应说明母药的组成和颜色 、物理状态 、形状等 。

　　4 . 3 规范项目及指标

　　真菌农药母药的规范项目应符合表 1 的要求，具体指标由各产品作出规定 。

　　表 1 真菌农药母药规范项目及指标

　　项 目

　　指 标

　　含菌量/[(单位名称)/g] ≥(或规定范围)

　　活菌率/% ≥(或规定范围)

　　毒力/(LD50 、LT50 或%等单位名称) ≤ (在……条件下)

　　杂菌率/% ≤

　　化学杂质a /% ≤

　　干燥减量/% ≤

　　细度(通过…… μm试验筛)a /% ≥

　　2

　　GB/T 21459 . 1—2008

　　表 1(续)

　　项 目

　　指 标

　　pH 值a (规定范围)

　　贮存稳定性和(或)热贮稳定性b /% ≥

　　(…… ℃贮存……个月或周的活菌率与其标明值的百分率)

　　(建议不低于 80%)

　　注：所列项 目可根据真菌的特性 、功能和产品具体情况适当增减

　　。

　　a 可选项 目 。

　　b 定期检测项 目 。

　　5 试验方法

　　除非另有说明，试验方法所用试剂级别应为化学纯以上，所述溶液均为水溶液 。

　　5 . 1 抽样

　　按照 GB/T 1605 中商品原药采样方法进行，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量不少于

　　100 g 。

　　5 . 2 鉴别试验

　　5 . 2 . 1 菌种鉴别

　　根据所提供的菌种形态学 、生物化学 、DNA分子特征或国际公认机构的鉴定特征，用显微观察法从生物形态上进行鉴定或采用其他(如生物化学 、DNA 片断序列)方法进行鉴定 。

　　根据形态学特征鉴别的表述一般应包括：菌落的颜色和形状，产孢器结构 、产孢细胞以及孢子的着生方式 、几何形状 、排列方式 、细胞分隔 、细胞核数 、表面凹凸和(或)纹饰 、大小等(参见第B. 1 章)。如果具有明显区别于其他相似真菌的形态，应特别指出 。必要时可附图和照片 。

　　根据生物化学特征的鉴别应指明所鉴别的化学物质名称 、检测方法和注意事项等 。必要时可附图或图谱 。

　　根据 DNA分子特征的鉴别应指出检测方法，包括引物碱基序列 、克隆载体名称 、操作步骤和注意事项等，并给出由鉴别试验得到的 DNA 片断序列图 。

　　5 . 2 . 2 菌种仲裁鉴定

　　当对鉴别结果有怀疑或争议时，应到具有菌种认证资质的单位，将在菌种保藏中心保藏的生产菌种及母药与模式菌种描述进行对照，由 2 名以上的专家确认后，出具菌种鉴定报告，作为仲裁依据 。

　　5 . 3 含菌量的测定

　　5 . 3 . 1 方法提要

　　根据母药中真菌的生物形态提出检测方法，简述方法基本原理 。

　　对分生孢子形态的母药建议采用显微计数法，即将母药润湿并稀释至适当倍数，在显微镜下用血球计数板计孢子数，然后计算含孢量(参见第 B. 2 章)。

　　分生孢子或其他形 态 的 母 药 均 可 采 用 菌 落 形 成 单 位 (colony forming unit;CFU) 的 方 法(参 见 第B. 3 章)，即将母药润湿 、稀释后，定量接种到培养基上，计有效成分真菌的菌落数，计算含菌量 。

　　5 . 3 . 2 试剂和溶液

　　试剂：(列出名称及其纯度或级别)。

　　溶液或悬浮液：(标出其浓度，对特殊的应写出具体配制和保存方法)。

　　培养基应列出其组分和比例，叙述配制方法和灭菌条件等 。

　　5 . 3 . 3 仪器及设备

　　列出试验用主要仪器 、设备，并说明其主要特性(技术要求)和特殊要求 。 当特殊要求在方法中影响安全以及方法的准确度和精确度时，必须写出 。

　　3

　　GB/T 21459 . 1—2008

　　特殊类型的仪器设备及其部件，应按制图标准，绘图说明 。

　　采用显微计数法计 含 孢 量 时，一 般 包 括 天 平(精 度 为 0 . 01 g) , 显 微 镜(物 镜 × 目 镜 倍 数 不 低 于400 倍)，高速 组 织 捣 碎 机(最 高 转 速 不 低 于 5 000 r/min) , 旋 涡 混 合 器(转 速 ≥ 2 000 r/min , 振幅 ≥5 mm),血球计数板(1/400 mm2 × 0 . 1 mm精度，建议用 25 × 16 规格)，计数器(1 ~ 9 999) ,玻璃器皿等 。

　　采用菌落形成单位法 时，除 上 述 仪 器 外，一 般 还 包 括 蒸 气 灭 菌 锅(标 明 规 格)，恒 温 培 养 箱 (5 ℃ ~ 60℃范围)，移液器等 。

　　5 . 3 . 4 试验步骤

　　应准确叙述试验的每一操作步骤，一般包括取样 、配制均匀悬浮液 、稀释 、计数 、接种 、观察等，如有预操作或需要定量的都应明确指出 。测定步骤中，可能涉及仪器校正 、空白测定 、工作曲线 、安全措施等都应叙述清楚 。

　　5 . 3 . 5 测定结果

　　应列出计算公式 、简化公式，写明公式中符号 、代号和系数的含义 、单位 。

　　5 . 3 . 6 允许误差

　　应规定每次平行测定结果误差范围，建议 ≤10% 。取其算术平均数作为真菌农药母药的含菌量，一般应不低于标明值的 90% 。

　　5 . 4 活菌率的测定

　　如果 5 . 3 采用菌落形成单位法或其他能确定活菌的方法检测含菌量，可取消此项检测试验 。

　　根据母药中真菌的生物形态特点提出检测方法 。对于分生孢子形态的母药一般采用接种培养后显微观察孢子萌发的方法(参见第 B. 4 章)。菌落形成单位法适用于各种生物形态的母药 。

　　编写要求和测定结果误差的限制范围参照 5 . 3 。

　　5 . 5 杂菌率的测定

　　一般采用菌落形成单位法，即接种培养，根据不同菌的生长速度和菌落形态特征，从平板上直接分辨菌落并计菌落数，计算杂菌率(参见第 B. 5 章)。

　　培养基可选用真菌与细菌通用的培养基，也可分别用细菌的 、真菌的专用培养基，必要时可用选择性培养基，但应作详细说明 。

　　根据需要可修订或提出其他方法，但应作说明，包括样品制备步骤 、测定步骤和计算方法等 。

　　编写要求和测定结果误差的限制范围参照 5 . 3 。

　　5 . 6 化学杂质的测定

　　根据母药特性和实际需要测定 。

　　5 . 7 毒力的测定

　　根据母药中所含真菌的生物活性功能不同，其毒力测定方法可能相差较大 。一般应包括以下内容 。

　　5 . 7 . 1 方法提要

　　应采用活体生物测定方法，简述测定方法的基本原理和步骤要点 。

　　5 . 7 . 2 试材

　　5 . 7 . 2 . 1 试材(虫 、菌 、植物等)的选择

　　尽量选用规范试材，应指明试材的种名 、品系 、生物龄 、来源及编号，并说明选择该试材的适当理由 。选择试材的理由一般有以下几方面：

　　a) 与防治对象同种或为近缘种;

　　b) 实验室纯品系最佳，天然试材应采自同一地点，尽量缩小范围，试材应便于人工饲养或培植;

　　c) 生物龄容易判断和整齐化;

　　d) 培育基质材料容易获得，且易于规范化 。

　　4

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　　5 . 7 . 2 . 2 试材(虫 、菌 、植物等)的培育(饲养 、培养或种植)

　　尽量采用规范的培育方法，应详细叙述培育试材所用的材料 、器具 、环境条件 、操作步骤，以及培育基质组分 、制备和培育方法等，并注明参考文献 。

　　5 . 7 . 3 试剂和溶液

　　视需要而定，应列出试剂名称及其纯度或级别，标出溶液浓度 。 特殊溶液应写出具体配制步骤 、保存方法和参考文献 。

　　5 . 7 . 4 仪器及设备

　　列出试样溶液配制 、试材培育 、接种 、观察 、检测等所需要的仪器设备，并说明其主要特性或规格 。有特殊要求的应详细叙述，必要时绘图说明 。

　　5 . 7 . 5 试验步骤

　　尽量采用规范的操作方法，应准确叙述试验的每一操作步骤，包括必要的预操作在内 。测定步骤中，可能涉及仪器校正 、空白测定 、工作曲线 、安全措施等都应叙述清楚 。

　　一般步骤为：

　　a) 样品的配制

　　视不同产品制定规程 。

　　b) 不同试验处理的设置

　　测定时应至少设置 5 个剂量处理，每个处理至少 3 个重复，每个重复试材个体数量可视情况而定，同时应有空白对照 。

　　c) 接种与接种后的管理

　　指明接种用具 、操作方法 、接 种 试 材 部 位 、接 种 量，并 提 示 注 意 事 项 及 规 定 温 度 、湿 度 、光 照 、饲 喂(虫)、浇水(植物)等管理条件 。

　　d) 观察与记录

　　包括观察时间 、频次，试材病变和死亡等 。

　　一般以试材死亡或被抑制作为判断母药达到有效作用的标准 。如果采用其他标准判断母药的有效作用，应详细说明所用标准的判断方法 。

　　5 . 7 . 6 测定结果

　　应列出计算公式 、简化公式，写明公式中符号 、代号和系数的含义 、单位 。

　　一般先根据空白对照，采用 Abbott 表或按式(1)计算校正死亡率或抑制率 Y( %) :

　　Y= …………………………( 1 )

　　式中：

　　T— 处理死亡率或抑制率，% ;

　　C— 空白对照死亡率或抑制率，% 。

　　C一般不大于 10%,否则试验无效 。

　　计算 LD50 的方法是将处理各剂量换算成对数值，校正死亡率转换成死亡几率值，用最小二乘法求出 。LT50 的计算方法相同 。

　　5 . 7 . 7 允许误差

　　应规定每次平行测定结 果 的 误 差 范 围，建 议 ≤20% 。 样 品 各 剂 量 引 起 的 死 亡 率 应 在 10% ~ 90%之间 。

　　5 . 8 干燥减量的测定

　　5 . 8 . 1 仪器及设备

　　扁型称量瓶：直径 40 mm ;

　　电热恒温干燥箱：控温误差±2 ℃ ;

　　5

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　　干燥器 。

　　5 . 8 . 2 试验步骤

　　称取试样(g,准确至 1 mg) ,置于预先称重的称量瓶中，将此瓶放入 105℃±2℃电热恒温干燥箱内干燥，1 h 后取出，在干燥器中冷却至室温，称重 。

　　5 . 8 . 3 测定结果

　　干燥减量 x(%)按式(2)计算：

　　x=(m-mm1) × 100 …………………………( 2 )

　　式中：

　　m— 试样的质量，单位为克(g) ;

　　m1 — 干燥后试样的质量，单位为克(g) 。

　　5 . 9 细度的测定

　　采用 GB/T 16150 中的干筛法进行 。

　　5 . 10 PH值的测定

　　按 GB/T 1601 进行 。

　　5 . 1 1 贮存稳定性和(或)热贮稳定性试验

　　根据产品特性进行贮存稳定性和(或)热贮稳定性试验 。一般是将样品在规定温度和条件下贮存，检测产品活菌率与其标明值的相对百分率，以确定不低于标明值 80%的贮存时间来表示 。

　　真菌宜贮存于低温环境中 。如果有在室温或低于室温贮存至少 6 个月，一般为 1 年或 2 年的贮存稳定性试验数据，可 直 接 采 用 。 如 果 没 有，热 贮 稳 定 性 试 验 的 结 果 可 以 作 为 产 品 贮 存 稳 定 性 的 先 行估计 。

　　在没有更合适的测定方法和指标时，可按以下建议选择至少一项进行检测：

　　a) 在 5℃下按规定时间(标明月数或天数)贮存后，活菌率不低于标明值的 80% ;

　　b) 在 15℃ ~ 20℃下按规定时间(标明月数或天数)贮存后，活菌率不低于标明值的 80% ;

　　c) 在 20℃ ~ 25℃下按规定时间(标明月数或天数)贮存后，活菌率不低于标明值的 80%或检测确定的数值;

　　d) 分别在 45℃±2℃ 、40℃±2℃ 、35℃±2℃ 、30℃±2℃下按规定时间(标明周数或天数)贮存后进行测定，活菌率与其标 明 值 的 相 对 百 分 率 不 低 于 80%或 检 测 确 定 的 数 值 。但 如 果 平 均 值有 ±25%的波动，就需要充分考虑 。

　　6 检验规则

　　应符合 GB/T 1604 有关规定 。极限值的处理按 GB/T 1250 ,采用修约值比较法 。

　　7 标志 、标签 、包装和贮运

　　7 . 1 标志标签

　　真菌农药母药的标志及标签应符合 GB 3796 的规定 。标签上还应注明贮运条件 。

　　7 . 2 包装

　　综合企业具体包装情况及真菌农药母药特性要求进行编写，应符合 GB 3796 和 GB/T 191 的规定 。根据用户要求或订货协议，可采用其他形式的包装 。

　　7 . 3 贮运

　　真菌农药母药包装件应贮存于干燥 、阴凉 、避光的库房内，并根据产品特性和需要，指明贮运限定温

　　6

　　GB/T 21459 . 1—2008

　　度及条件 。运输时要轻拿轻放，避免挤压，防止雨淋 、日 晒 。不应与粮食 、食品 、饲料混放或混运 。避免与皮肤 、眼睛接触，防止由口鼻吸入 。

　　7 . 4 安全

　　在使用说明书或包装标签上应注明毒性 、防护措施等 。

　　7 . 5 验收期

　　应规定真菌农药母药从交货到验收的最长期限(以月计)。

　　7

　　GB/T 21459 . 1—2008

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　真菌农药母药有效成分描述格式

　　产品中有效成分的名称 、登记号和基本生化参数如下：

　　菌种中文通用名：……

　　菌种中文别名：……

　　菌种拉丁文学名：属，种，亚种 、变种或专化型及定名人 。

　　菌种拉丁文学名异名：属，种，亚种 、变种或专化型 。

　　菌种来源及株系分型或代码：获得地点或单位 、原寄主 、人工处理如诱变等 。

　　生物学分类地位：纲 、目 、科 。

　　鉴定特征：形态学 、生物化学或遗传学特征 。应尽可能提供从国际公认机构能得到的鉴定特征的参考文献 。如果使用基因修饰过的菌株，还应陈述相关信息，对有特定基因序列的应指出登记号 。

　　菌种保藏机构及登记号或编号：……

　　菌种保存条件：温度 、湿度 、避光 、封装等 。

　　有效成分主要存在形态：分生孢子 、芽生孢子 、菌丝体等 。

　　生物活性：防治虫 、螨 、菌 、草 、鼠或线虫等的类别或具体名称 。

　　适宜生长条件：培养基碳 、氮源，特需组分;最适温 、湿度;其他指定条件 。

　　适宜贮存温 、湿度：……

　　注：此部分应写在标题之后 、范围之前 。

　　8

　　GB/T 21459 . 1—2008

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　真菌农药母药鉴定 、检测方法及示例

　　B.1 以分生孢子形态学为鉴定特征的表述示例

　　在……培养基上，菌落的菌丝呈……色……状(如绒状 、絮状 、卷毛状 、粉状等)，背面……色或无色，菌落产孢后呈……色或由……色转变为……色 。分生孢子梗单生/聚集，有/无分隔，有/无分枝，直立/弯曲，壁光滑/粗糙，…… 。产孢细胞呈……形(如瓶形 、锥形等)，单生/对生/轮生/簇生于分生孢子梗的顶端 。分生孢子为单细胞/多细胞，呈……形(如圆形 、椭圆形 、肾形 、菱形 、针形等)，表面光滑/粗糙/有疣突或……纹饰，大小为…… μm ~ …… μm 或 …… μm ~ …… μm×…… μm ~ …… μm 。

　　B.2 含孢量的测定示例

　　适用于真菌形态为分生孢子的母药，含孢量即含菌量 。

　　B.2 . 1 方法提要

　　将母药润湿并稀释至适当倍数，在显微镜下用血球计数板计孢子数，然后计算含孢量 。

　　B.2 . 2 试剂和溶液

　　试剂：吐温 80(化学纯);

　　溶液：0 . 1%吐温 80 。

　　B.2 . 3 仪器及设备

　　天平(精度为 0 . 01 g) ;

　　显微镜(物镜 × 目镜 400 倍);

　　高速组织捣碎机(最高转速 ≥5 000 r/min) ;

　　旋涡混合器(转速 ≥2 000 r/min,振幅 ≥5 mm) ;

　　血球计数板(1/400 mm2 × 0 . 1 mm , 25 × 16 规格);

　　移液器;

　　手揿计数器(1 ~ 9 999) 。

　　B.2 . 4 试验步骤

　　a) 称取母药样品……g(至少 1 g,精确至 0 . 01 g),共称取 n 个试样(一般 n≥3) ,分别进行以下操作 。

　　b) 将 1 份样品置于捣碎机的盛液杯中，加入 0 . 1%吐温 80 溶液 …… mL(试样量 1 g 时一般 加100 mL),缓慢搅拌，尽量使孢子充分润湿;加蒸馏水…… mL(一般为 200 mL,所加水体积可根据盛液杯大小调整，以浸没钻头刀片之上 2 cm左右为宜)，以 5 000 r/min速度(或接近的转速)搅 拌 …… min(一 般 为 1 min) , 静 置 约 …… min(一 般 为 1 min) 后，以 相 同 速 度 再 搅拌 …… min(一般为 1 min) 。

　　c) 静置……s(一般约 30 s) ,用移液管从溶液中部移取孢子悬浮液…… mL(一般为 2 mL) 到试管中，加蒸馏水…… mL(一般为 8 mL) ,于旋涡混合器上振荡……s(一般约 30 s) 。

　　d) 重复 c)步骤n次[根据称取样量和预计样品含菌量而定，应使 f) 步骤中计数 5 中格孢子数为100 ~ 500 为宜]。

　　e) 用玻棒蘸 1 小滴水涂抹在血球计数板计数区两侧的凸条上，盖上盖玻片，使之贴紧固定 。 在

　　d)步骤后静置……s(一般约 30 s) ,用细头吸管从溶液中部吸取孢子悬浮液，在盖玻片边缘滴1 滴，使液体沿边缘渗入盖玻片下，刚好充满盖玻片与计数板计数区域之间，应无气泡且计数

　　9

　　GB/T 21459 . 1—2008

　　区域四周凹槽无液体，如有多余液体，用小条吸水纸吸去 。

　　f) 用显微镜观察，待孢子静止后进行计数 。在规划格区内，计四周及中央的 5 个中格即双线范围内 80 小格 。每中格四周如有压线的孢子，计上线不计下线，计左线不计右线 。

　　g) 重复点样计数 p 次(一般 p≥3) 。

　　B.2 . 5 测定结果

　　称取样品的含孢量 Xi(i=1-n，个孢子/g) ,按式(B. 1)计算：

　　Xi

　　式中：

　　i— 称取样品序号;

　　K— 稀释倍数;

　　N—p 次计数的总孢子数;

　　p— 计数次数;

　　m— 取样量，单位为克(g) 。

　　母药的含孢量 X1(个孢子/g) ,按式(B. 2)计算：

　　i= 1 -n

　　X …………………………( B. 2 )

　　式中：

　　i— 称取样品序号;

　　n— 称取样品次数 。

　　B.3 菌落形成单位(CFU)法

　　本部分中 CFU 法适用于检测母药中有效成分真菌活菌数和杂菌数 。

　　一般操作步骤为：

　　a) 按组分和比例配制培养基，灭菌后凉至 45℃左右，将 15 mL ~ 20 mL 倒入直径 9 mm 培养皿中，制成 3 mm ~ 4mm厚的平板 。

　　b) 参照 B. 2 . 4 中 a) ~ d)操作步骤称样 、匀散 、稀释 。稀释倍数依具体情况而定或同时做几个稀释梯度 。一般检测有效成分时使每平板菌落数为 100 ~ 300 ,检测杂菌时菌落数 ≤20 。

　　c) 用微量移 液 器 接 种 100 μL 菌 液 到 培 养 基 平 板 上，用 曲 玻 棒 涂 布 均 匀 。 重 复 n 块 平 板( 一般n≥5) 。

　　d) 在…… ℃下(一 般 为 25℃) 培 养 ……h(一 般 为 24 h) ,计 细 菌 菌 落 数;培 养 至 ……h(一 般 为48 h) ,计真菌菌落数，根据菌落特征分辨有效成分真菌或污染的真菌 。

　　B.4 孢子萌发率测定

　　当采用显微计数法测定含孢量作为含菌量时，由于不能分辨孢子是否存活，才需要补充测定此项 。

　　B.4 . 1 一般试验步骤为：

　　a) 按组分和比例配制培养基，灭菌后凉至 45℃左右，制成 1 mm ~ 2 mm厚的平板 。

　　b) 按 B. 2 . 4 操作步骤 称 样 、润 湿 、稀 释 、计 数，然 后 配 成 10 6 个 孢 子/mL ~ 10 7 个 孢 子/mL 的 孢悬液 。

　　c) 接种约 200 μL 到 a)制备的平板上，并用曲玻棒涂布均匀，重复n块平板(一般n≥3) 。

　　d) 在恒温…… ℃下(一般 25℃)培养……h(一般为 24 h) ,用显微镜观察平板，计孢子萌发数，以芽管长度大于孢子半径或 1/2 长轴长度的孢子计为萌发孢子 。每平板观察 n 次视野(n≥3) ,观察孢子总个数不少于 300 个 。

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　　GB/T 21459 . 1—2008

　　B.4 . 2 孢子萌发率即活孢率 x2 ( %)按式(B. 3)计算：

　　x …………………………( B. 3 )

　　式中：

　　N1 — 萌发孢子个数总和;

　　N2 — 未萌发孢子个数总和 。

　　B.5 杂菌率的测定

　　采用菌落形成单位法 。试验步骤按 B. 3 进行 。

　　杂菌率 x3 ( %)按式(B. 4)计算：

　　x …………………………( B. 4 )

　　式中：

　　N1 — 细菌杂菌菌落数总和;

　　N2 — 真菌杂菌菌落数总和;

　　N3 — 有效成分真菌菌落数总和 。