GB/T 18448.2-2008 实验动物 弓形虫检测方法

　　ICS 65 . 020 . 30 B 44

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 18448 . 2—2008代替 GB/T 18448 . 2—2001

　　实验动物 弓形虫检测方法

　　Laboratory animal—Method forexamination ofToxoplasmagondi

　　2008-12-03 发布 2009-03-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 18448 . 2—2008

　　前 言

　　GB/T 18448《实验动物》由 10 项实验动物寄生虫检测方法组成 。

　　本部分为 GB/T 18448 的第 2 部分《实验动物 弓形虫检测方法》。

　　本部分自实施之日起代替 GB/T 18448 . 2—2001 。

　　本部分与 GB/T 18448 . 2—2001 相比主要技术差异如下：

　　a) 增加弓形虫酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫酶染色试验(IEA) ,将 PCR 检测方法列入附录内容，保留间接血凝试验(IHA)作为推荐方法之一;

　　b) 将检测方法所需的 “材料与试剂 ”和 “检测步骤 ”分别叙述 。

　　本部分附录 A是规范性附录 。

　　本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归 口 。

　　本部分起草单位：全国实验动物标准化技术委员会 。

　　本部分主要起草人：潘振业 、屈霞琴 、陈俏梅 、李冠民 、王彦平 。

　　本部分所代替标准的历次版本发布情况为：

　　—GB/T 14926 . 34—1994 , GB/T 18448 . 2—2001 。

　　Ⅰ

　　GB/T 18448 . 2—2008

　　实验动物 弓形虫检测方法

　　1 范围

　　GB/T 18448 的本部分规定了实验动物弓形虫的检测方法和试剂等 。

　　本部分适用于小鼠 、大鼠 、地鼠 、豚鼠 、兔 、犬及猴等实验动物弓形虫的检测 。

　　2 原理

　　根据免疫学原理，采用弓形虫抗原检测被检动物血清中的弓形虫抗体 。

　　3 主要试剂和器材

　　3 . 1 试剂

　　3 . 1 . 1 ELISA抗原

　　3 . 1 . 1 . 1 特异性抗原

　　弓形虫(RH 株)速殖子腹腔接种清洁级以上实验小鼠(KM 、ICR 、BALB/c 等均可)，3 d ~ 5 d后，以无菌生理盐水灌洗被接种小鼠的腹腔，收集含有虫体的小鼠腹腔液，3 000 r/min 离心 10 min,取沉淀， PBS洗 3 次 。沉淀物加适量蒸馏水反复冻融 5 次，或用超声波处理后，10 000 r/min 离心 30 min,取上清液 。上清液用葡聚糖凝胶 G200 进行纯化(柱内径 ×柱高：1 . 5 cm×60 cm) ,流速为 0 . 2 mL/min 。 每管收集 2 mL左右 。共收集 60 管以上 。分别测定每个收集管中蛋白在 280 nm下的吸光度值 。分离纯化后，出现 2 个蛋白峰;将第一峰各管合并，即为弓形虫特异性抗原(也称弓形虫可溶性抗原)。

　　3 . 1 . 1 . 2 正常抗原

　　以无菌生理盐水注射清洁级以上实验小鼠(与制备抗原的小鼠同品种或品系)腹腔，3 d ~ 5 d 后，以无菌生理盐水灌洗被注射小鼠腹腔，收集小鼠腹腔液，3 000 r/min 离心 10 min,取沉淀，PBS 洗 3 次 。沉淀物加适量蒸馏水反复冻融 5 次，或用超声波处理后，10 000 r/min 离心 30 min,取上清液，即为正常抗原 。

　　3 . 1 . 2 抗原片

　　弓形虫 RH 株速殖子腹腔接 种 清 洁 级 以 上 实 验 小 鼠(KM 、ICR 、BALB/c 等 均 可)，3 d ~ 5 d 后 处死，收取虫体，胰酶消化，以一定浓度涂片，充分晾干后冷丙酮固定，-20 ℃保存 。

　　3 . 1 . 3 弓形虫抗原致敏绵羊红细胞

　　将绵羊红细胞与一定浓度的鞣酸液反应，制成鞣化红细胞，然后，用弓形虫可溶性抗原在适宜的条件下致敏鞣化红细胞，制成弓形虫抗原致敏绵羊红细胞 。

　　3 . 1 . 4 正常对照绵羊红细胞 。

　　3 . 1 . 5 阳性对照血清

　　自然感染弓形虫的相应动物抗体阳性血清，或弓形虫免疫血清 。

　　3 . 1 . 6 阴性对照血清

　　确证无弓形虫感染的动物血清 。

　　3 . 1 . 7 酶结合物

　　辣根过氧化物酶标记的抗小鼠 、大鼠 、地鼠 、豚鼠 、兔 、犬和猴 IgG 抗体;或辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白 A(SPA) 。

　　3 . 1 . 8 荧光素结合物

　　异硫氰氢酸荧光素标记的抗小鼠 、大鼠 、地鼠 、豚鼠 、兔 、犬和猴 IgG抗体 。

　　1

　　GB/T 18448 . 2—2008

　　3 . 1 . 9 包被液(0 . 05 mol/L , pH 9 . 6)

　　碳酸钠 1 . 59 g

　　碳酸氢钠 2 . 93 g

　　蒸馏水 加至 1 000 mL

　　3 . 1 . 10 PBS(0 . 01 mol/L , pH 7 . 4)

　　氯化钠 8 g

　　氯化钾 0 . 2 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ·12H2 O) 2 . 83 g

　　蒸馏水 加至 1 000 mL

　　3 . 1 . 1 1 洗涤液

　　PBS(0 . 01 mol/L , pH 7 . 4) 1 000 mL

　　Tween-20 0 . 5 mL

　　3 . 1 . 12 稀释液

　　含 1%牛血清白蛋白的 PBS 。

　　3 . 1 . 13 磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH 5 . 0)

　　柠檬酸 3 . 26 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ·12H2 O) 12 . 9 g

　　蒸馏水 700 mL

　　3 . 1 . 14 ELISA底物溶液

　　磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH 5 . 0) 10 mL

　　邻苯二胺(OPD) 4 mg

　　30%过氧化氢 2 μL

　　3 . 1 . 15 终止液(2 mol/L硫酸)

　　硫酸 58 mL

　　蒸馏水 442 mL

　　3 . 1 . 16 IEA底物溶液

　　3 , 3-二胺基联苯胺盐酸盐(DAB) 40 mg

　　PBS(0 . 01 mol/L , pH 7 . 4) 100 mL

　　丙酮 5 mL

　　30%过氧化氢 0 . 1 mL

　　3 . 2 器材

　　3 . 2 . 1 酶标仪 。

　　3 . 2 . 2 荧光显微镜 。

　　3 . 2 . 3 常规的光学显微镜 。

　　3 . 2 . 4 37 ℃培养箱或水浴箱 。

　　3 . 2 . 5 微量血凝反应板(U 型或 V 型)。

　　3 . 2 . 6 震荡器 。

　　3 . 2 . 7 微量加样器(5 μL ~ 100 μL) 。

　　4 检测方法

　　4 . 1 间接血凝法(IHA)

　　4 . 1 . 1 取样

　　4 . 1 . 1 . 1 采血约 1 mL(小鼠 、大鼠 、地鼠眶静脉窦采血;豚鼠心脏采血;兔耳部采血;犬和猴后肢静脉采

　　2

　　GB/T 18448 . 2—2008

　　血)，凝血试管斜放待凝，置 4 ℃冰箱 2 h 。

　　4 . 1 . 1 . 2 2 h后，从冰箱中取出凝血试管，轻轻吸取血清移入另一试管中 。

　　4 . 1 . 1 . 3 将分离出的血清置 56 ℃水浴中灭活 30 min,备用 。

　　4 . 1 . 2 加样

　　在微量反应板上，依次对每份血清进行倍比稀释，每份血清稀释两横排，每孔留量为 25 μL 。 同时设阳性对照 、阴性对照和空白对照 。

　　4 . 1 . 3 加致敏红细胞

　　第一横排滴加弓形虫致敏红细胞 25 μL , 第二横排滴加正常对照绵羊红细胞 25 μL 。将加好样品的微量反应板置震荡器上震荡 3 min ~ 5 min,使致敏红细胞与待检的稀释血清充分混合，置 15 ℃ ~ 28 ℃室温下过夜后判定结果 。

　　4 . 1 . 4 结果记录

　　在对照系统(阴性血清对照 、阳性血清对照 、空白对照)成立的条件下判定结果 。

　　4 . 1 . 4 . 1 红细胞呈膜状均匀沉于孔底，中央无沉点或沉点小如针尖，记为“++++”。

　　4 . 1 . 4 . 2 红细胞虽呈膜状沉着，但颗粒较粗，中央沉点较大，记为“+++”。

　　4 . 1 . 4 . 3 红细胞部分呈膜状沉着，周围有凝集团点，中央沉点大，记为“++”。

　　4 . 1 . 4 . 4 红细胞沉集于中心，周围有少量颗粒状沉着物，记为“+”。

　　4 . 1 . 4 . 5 红细胞沉集于中心，周围无沉着物，分界清楚，记为“-”。

　　4 . 1 . 5 结果判定

　　出现“++ ”孔的血清最高稀释倍数定为本间接血凝试验的凝集效价 。 小于或等于 1 ∶ 16 判为阴性;1 ∶ 32 判为可疑;等于或大于 1 ∶ 64 判为阳性 。

　　4 . 2 酶联免疫吸附试验法(ELISA)

　　4 . 2 . 1 包被抗原

　　根据滴定的最适工作浓度，将特异性抗原和正常抗原分别 用 包 被 液 稀 释 。 每 孔 100 μL,置 37 ℃ 2 h , 4 ℃过夜 。

　　4 . 2 . 2 洗涤液洗 5 次，每次 3 min,叩干 。

　　4 . 2 . 3 加样

　　4 . 2 . 3 . 1 采血样约 1 mL/只(小鼠 、大鼠 、地鼠眶静脉窦采血;豚鼠心脏采血;兔耳部采血;犬和猴后肢静脉采血)，凝血试管斜放待凝，置 4 ℃冰箱 2 h 至过夜 。

　　4 . 2 . 3 . 2 2 h后，从冰箱中取出凝血试管，轻轻吸取血清移入另一试管中 。

　　4 . 2 . 3 . 3 将待检 血 清 用 稀 释 液 做 1 ∶ 20 稀 释，分 别 加 入 两 孔(特 异 性 抗 原 孔 和 正 常 抗 原 孔)，每 孔

　　100 μL,同时做阴性 、阳性对照血清和空白对照，置 37 ℃ 1 h ~ 1 . 5 h后，洗涤同上 。

　　4 . 2 . 4 加酶结合物

　　用稀释液将酶结合物稀释成适当浓度，每孔加入 100 μL,置 37 ℃ 1 h ~ 1 . 5 h ,洗涤同上 。

　　4 . 2 . 5 加底物溶液

　　每孔加入新配制的底物溶液 100 μL,置室温，避光显色 5 min ~ 10 min 。

　　4 . 2 . 6 终止反应

　　每孔加入终止液 50 μL 。

　　4 . 2 . 7 测 A值

　　在酶标仪上，于 490 nm处读出各孔 A值 。

　　4 . 2 . 8 结果判定

　　4 . 2 . 8 . 1 在对照系统(阴性血清对照 、阳性血清对照 、空白对照)成立的条件下判定结果 。

　　4 . 2 . 8 . 2 同时符合下列 3 个条件者，判为阳性：

　　a) 待检血清与正常抗原和特异性抗原反应有明显的颜色区别;

　　3

　　GB/T 18448 . 2—2008

　　b) 待检血清与特异性抗原反应的 A值 ≥0 . 2 ;

　　c) 待检血清与特异性抗原反应的 A值/阴性血清与特异性抗原反应的 A值 ≥2 . 1 。

　　4 . 2 . 8 . 3 均不符合上述 3 个条件者，判为阴性;仅有 1 条 ~ 2 条符合者，判为可疑;需选用同一种方法或另一种方法重试 。

　　4 . 3 免疫荧光试验法(IFA)

　　4 . 3 . 1 取出抗原片(3 . 1 . 2) ,置室温干燥或冷风吹干 。

　　4 . 3 . 2 将待检血清(4 . 2 . 3 . 1 ~ 4 . 2 . 3 . 2) 用 PBS 按 1 ∶ 10 稀 释 后，滴 于 抗 原 片 上，置 湿 暗 盒 内，37 ℃ 45 min 。 同时做阴性 、阳性血清对照和空白对照 。

　　4 . 3 . 3 PBS漂洗 3 次 ~ 5 次，每次 3 min,室温干燥或冷风吹干 。

　　4 . 3 . 4 将适当稀释的荧光抗体滴加于抗原片上，置湿暗盒内，37 ℃ 45 min 。

　　4 . 3 . 5 PBS漂洗 3 次 ~ 5 次，每次 3 min 。

　　4 . 3 . 6 50%甘油 PBS封片，荧光显微镜下观察 。

　　4 . 3 . 7 结果判定：在对照系统成立的条件下，即阴性血清和 PBS与抗原片上的弓形虫虫体反应均无荧光;阳性血清与弓形虫虫体反应有荧光，即可判定结果 。

　　待检血清与弓形虫虫体反应无荧光，判为阴性 。

　　待检血清与弓形虫虫体反应有荧光反应，判为阳性 。根据荧光反应的强弱可判为 +～ ++++。

　　4 . 4 免疫酶试验法(IEA)

　　4 . 4 . 1 取出抗原片(3 . 1 . 2) ,置室温干燥或冷风吹干 。

　　4 . 4 . 2 将待检血清(4 . 2 . 3 . 1 ~ 4 . 2 . 3 . 2) 用 PBS 按 1 ∶ 10 稀 释 后，滴 于 抗 原 片 上，置 湿 暗 盒 内，37 ℃ 45 min 。 同时做阴性 、阳性血清对照和空白对照 。

　　4 . 4 . 3 PBS漂洗 3 次 ~ 5 次，每次 3 min,室温干燥或冷风吹干 。

　　4 . 4 . 4 将适当稀释的酶结合物滴加于抗原片上，置湿暗盒内，37 ℃ 45 min 。

　　4 . 4 . 5 PBS漂洗 3 次 ~ 5 次，每次 3 min 。室温干燥或冷风吹干 。

　　4 . 4 . 6 将底物溶液滴加于抗原片上，置室温暗盒内，显色 5 min ~ 10 min 。PBS 漂洗 3 次，再用蒸馏水漂洗 1 次 。

　　4 . 4 . 7 中性树脂封片，光学显微镜下观察 。

　　4 . 4 . 8 结果判定：在对照系统成立的条件下，即阴性血清和 PBS 与抗原片 上 的 弓 形 虫 虫 体 反 应 均 无色;阳性血清与弓形虫虫体反应呈棕褐色，即可判定结果 。

　　待检血清与弓形虫虫体反应呈无色，判为阴性 。

　　待检血清与弓形虫虫体反应呈棕褐色，判为阳性 。根据颜色深浅可判为 +～ ++++。

　　4 . 5 PCR检测方法

　　见附录 A 。

　　5 结果判定

　　待检样品用一种方 法 检 测 出 现 可 疑 或 阳 性 时，应 选 用 同 一 种 或 另 一 种 方 法 重 检，重 检 阳 性 则 为阳性 。

　　6 结果报告

　　根据判定结果，作出报告 。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　实验动物 弓形虫检测方法(PCR法)

　　A.1 范围

　　本附录规定了实验动物弓形虫 PCR 检测方法 。

　　本附录适用于小鼠 、大鼠 、地鼠 、豚鼠 、兔 、犬及猴等实验动物弓形虫的检测 。

　　A.2 原理

　　虫体 DNA加热变性后，人工合成的两条特异性引物分别与虫体 DNA 两翼序列特异变性，在合适条件下，由耐热 DNA 聚合酶催化引物引导的虫体 DNA 合成(即延伸)，完成热变性— 复性— 延伸的 PCR循环，通过 30 次左右的循环扩增，可通过琼脂糖凝胶电泳检查虫体 DNA 特异性条带 。

　　A.3 主要试剂和器材

　　A.3 . 1 试剂

　　A.3 . 1 . 1 血细胞洗涤液：若样品为全血，采用 0 . 83% NH4 Cl 溶液洗涤 。

　　A.3 . 1 . 2 DNA 裂 解 液 [10 mmol/L Tris(pH 7 . 4) , 10 mmol/L EDTA , 150 mmol/L NaCl , 0 . 4% SDS , 100 μg/mL蛋白酶 K] 。

　　A.3 . 1 . 3 苯酚-三氯甲烷抽提液(苯酚 ∶ 三氯甲烷为 1 ∶ 1) 。

　　A.3 . 1 . 4 TE缓冲溶液(1 mL 1 mol/L Tris-His pH 8 . 0 , 0 . 2 mL 0 . 5 mol/L EDTA pH 8 . 0 ,总体积100 mL) 。

　　A.3 . 1 . 5 TBE缓冲液 。

　　A.3 . 1 . 6 TaqDNA 聚合酶 。

　　A.3 . 1 . 7 引物

　　A.3 . 1 . 7 . 1 一次 PCR 引物 按 B1 基因序列设计

　　1 . 上游引物：5 ’GGAACTGCATCCGTTCATGAG3 ’(694 bp ~ 714 bp)

　　2 . 下游引物：5 ’TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC3 ’(887 bp ~ 868 bp)

　　扩增产物为 194 bp 。

　　A.3 . 1 . 7 . 2 套式 PCR 引物 按 P30 基因序列设计引物P1 为 5 ’GCGAATTCATGTCAGATCCCCCT3 ’

　　P2 为 5 ’GTGGATCCTCACGCGACACAAGCT3 ’

　　P3 为 5 ’CGACAGCCGGTCATTCTC3 ’

　　P4 为 5 ’GCAACCAGTCAGCGTCGTCC3 ’

　　P1 和 P2 的预扩增产物为 889 bp, P3 和 P4 的预扩增产物为 520 bp 。

　　A.3 . 1 . 8 10×PCR反应缓冲液(含 MgCl2 15 mmol/L) 。

　　A.3 . 1 . 9 dNTP：各为 10 mmol/L 。

　　A.3 . 1 . 10 阳性对照(模板 DNA) ：弓形虫 DNA 片段 。

　　制备方法(有条件的实验室可参考)：将 RH 株弓形虫速殖子接种小鼠腹腔，3 d ~ 4 d 后处死 。 用NS洗腹腔，收集腹腔液，离心 弃 上 清，沉 淀 悬 浮 于 裂 解 液(含 SDS 和 蛋 白 酶 K) 中，55 ℃消 化 2 h ,再100 ℃处理 10 min 。 虫 体 消 化 液 用 苯 酚，三 氯 甲 烷 抽 提 数 次，70%乙 醇 沉 淀 DNA, 再 溶 解 于 TE 溶液内 。

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　　A.3 . 1 . 1 1 阴性对照：蒸馏水或 TE溶液 。

　　A.3 . 1 . 12 DNA marker 。

　　A.3 . 1 . 13 2%琼脂糖 。

　　A.3 . 1 . 14 0 . 5 × TBE 电泳缓冲液 。

　　A.3 . 1 . 15 0 . 5 mg/mL溴乙锭 。

　　A.3 . 2 器材

　　A.3 . 2 . 1 DNA扩增仪 。

　　A.3 . 2 . 2 微量移液器 。

　　A.3 . 2 . 3 冷冻高速离心机 。

　　A.3 . 2 . 4 电泳仪 。

　　A.3 . 2 . 5 水浴锅 。

　　A.3 . 2 . 6 紫外检测仪 。

　　A.3 . 2 . 7 摄影器材 。

　　A.3 . 2 . 8 0 . 5 mL 和 1 . 5 mL 塑料离心管 。

　　A.4 操作步骤

　　A.4 . 1 待检标本的处理

　　A.4 . 1 . 1 抽取待检动物的血液或腹腔液，以及相关组织 。

　　A.4 . 1 . 2 全血：取待检动物全血 0 . 2 mL,加入 5×体积的 0 . 83% NH4 Cl 中，冰浴 20 min , 6 000 r/min离心 5 min,弃上清，在细胞沉淀中再加入 1 mL上述溶液，6 000 r/min 离心，重复 1 次 ~ 2 次(去除红细胞)，在沉淀中加入 250 mL裂解液 。 消化，提纯过程同模板 DNA 的制备 。

　　A.4 . 1 . 3 腹水：取待检 动 物 腹 水 离 心 弃 上 清，在 沉 淀 中 加 入 250 mL 裂 解 液，消 化，提 纯 过 程 同 模 板DNA 的制备 。

　　A.4 . 1 . 4 各种组织：取适量待检动物肝 、脾 、子宫 、肾脏等制成匀浆，加入等体积裂解液，消化，提纯过程同模板 DNA 的制备 。

　　A.4 . 2 PCR实验

　　A.4 . 2 . 1 一次 PCR

　　总体积 50 μL , 内含 10 mmol/L pH 8. 3 Tris-HCl , 50 mmol/L KCl , 2 mmol/L MgCl2 , 0 . 2 mmol/L dNTPs,样品 3 μL ~ 5 μL,引物 1 、引物 2 各 10 pmol 。上述反应液先预变性，然后加入 Taq酶 2 U ,混匀 。覆盖液体石蜡 50 μL,进行扩增 。PCR 反应条件：预变性为 94 ℃ , 3 min ; 94 ℃ , 30 s , 60 ℃ , 30 s , 72 ℃ , 30 s , 41 个循环，最后 72 ℃ , 7 min 。

　　A.4 . 2 . 2 套式 PCR

　　第 1 次扩 增：总 体 积 50 μL , 内 含 10 mmol/L pH 8 . 3 Tris-HCl , 50 mmol/L KCl2 , 2 mmol/L MgCl2 , 0 . 2 mmol/L dNTPs,样品 1 μL ~ 2 μL,引物 P1 和 P2 各 10 pmol 。上述反应液先预变性，然后加入 Taq酶 2U ,混匀，覆盖液体石蜡 50 μL 。第 2 次扩增：取第一次扩增产物 1 μL ~ 2 μL,引物 P3 和P4 各 10 pmol , 其他同第 1 次扩增 。巢式 PCR 反应参数：预变性为 94 ℃ , 3 min ; 94 ℃ , 1 min , 55 ℃ , 1 min , 72 ℃ , 2 min , 30 个循环，最后 72 ℃ , 8 min 。

　　A.4 . 3 扩增产物的检定

　　A.4 . 3 . 1 一次 PCR: 5 μL扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳(含 0 . 5 mg/mL 溴乙锭)分离，(0 . 5 × TBE电泳缓冲液电泳，电压 5 V/cm , 1 h ~ 1 . 5 h) ,在紫外灯检测仪观察是否有 194 bp 扩增条带 。

　　A.4 . 3 . 2 套式 PCR：第一次扩增后(同一次 PCR) 产物，经第二次扩增后，电泳检测(同一次 PCR) ,在紫外灯检测仪观察是否有 520 bp 的扩增带 。

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　　A.5 结果判断

　　A.5 . 1 一次 PCR：在阳性 、阴性对照成立的条件下，即模板 DNA 的扩增产物经电泳检测可见到194 bp扩增条带，阴性对照的扩增产物经电泳检测未见到 194 bp 扩增时，可判定弓形虫检测结果 。

　　琼脂糖凝胶电泳板在紫外灯检测仪上观察到 194 bp 扩增条带，弓形虫检测阳性 。

　　琼脂糖凝胶电泳板在紫外灯检测仪上未观察到 194 bp 扩增条带，弓形虫检测阴性 。

　　A.5 . 2 套式 PCR：在阳性 、阴性对照成立的条件下，即模板 DNA 的第一次扩增产物经第二次扩增后，电泳检测，可以见到有 520 bp 的扩增带;阴性对照未见到相应扩增带，可判定弓形虫检测结果 。

　　第一次扩增后产物经第二次扩增后见到有 520 bp 的扩增带，弓形虫检测阳性 。

　　第一次扩增后产物经第二次扩增后未见到有 520 bp 的扩增带，弓形虫检测阴性 。

　　A.6 注意事项

　　A.6 . 1 整个检测工作应遵循 PCR 实验室规范，加强安全防护，应有四个隔开的工作区域，分别从事试剂储存和准备 、标本制备 、扩增和扩增产物分析，以避免发生潜在的交叉污染 。

　　A.6 . 2 整个检测工作应加强生物安全防护意识，特 别 是 由 虫 蛛 攻 击 小 鼠 产 生 阳 性 腹 水，并 制 备 模 板DNA 的工作，必须在生物安全防护 2 级的条件下进行 。

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　　开本 880 × 1230 1/16 印张 0 . 75 字数 14 千字

　　2009 年 2 月第一版 2009 年 2 月第一次印刷

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