GB/T 15699-2013 烟草霜霉病检疫规程

　　ICS 65. 160 X 85

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 15699—2013代替 GB 15699—1995

　　烟草霜霉病检疫规程

　　Rulesfortobacco bluemoldquarantine

　　2013-11-12发布 2014-04-11 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 15699—2013

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准代替 GB 15699—1995《烟草种子霜霉病检疫规程》, 与 GB 15699—1995相比主要技术变化如下 :

　　— 将适用范围扩大为 “各种入境烟草种子 、种 苗 和 烟 叶 的 霜 霉 病 检 疫 ”(见 第 1 章 , 1995年 版 的第 1 章) ;

　　— 增加了 “规范性引用文件 ”(见第 2 章) ;

　　— 增加了 “技术原理 ”(见第 4章) ;

　　— 增加了 “烟叶和种苗 ”的取样(见 6. 1. 2 和 6. 1. 3) ;

　　— 增加了 “烟叶和种苗 ”中孢子囊和孢子梗的检验(见 6. 2. 2 和 6. 2. 3) ;

　　— 增加了 “烟叶 ”中卵孢子的检测(见 6. 3. 2) ;

　　— 删除了附录部分(1995年版的附录 A、附录 B、附录 C 和附录 D) ;

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本标准由国家烟草专卖局提出 。

　　本标准由全国烟草标准化技术委员会农业分技术委员会(SAC/TC 144/SC2)归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国农业科学院烟草研究所 。

　　本标准主要起草人 :冯全福 、孔凡玉 、封立平 、贾兴华 、李启新 、张成省 、陈长法 、高连喜 。

　　本标准所代替标准的历次版本发布情况为 :

　　—GB 15699—1995。

　　Ⅰ

　　GB/T 15699—2013

　　烟草霜霉病检疫规程

　　1 范围

　　本标准规定了烟草霜霉病检疫的程序和方法 。

　　本标准适用于各种入境烟草种子 、种苗和烟叶的霜霉病检疫 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 18086—2000 植物检疫 烟霜霉病菌检疫鉴定方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　检疫 quarantine

　　为预防危险性烟草病虫害传播蔓延采取的一种措施 。

　　3. 2

　　烟草霜霉病 tobacco bluemold

　　又名蓝霉病 , 由烟草霜霉菌(Peronosporatabacina )引起 , 主要为害烟草叶片 ,亦可系统侵染根 、茎维管束 ,是一种传播迅速具有毁灭性的病害 。

　　注 : 该病发生于欧洲 、美洲 、澳洲 , 目前我国尚无该病发生 , 因此作为对外检疫对象 。病原为 Peronsporahyoscyami f. sptabacina Adam ,异 名 Peronsporanicotianae Speg, Peronosporatabacina Adam , 属 鞭 毛 菌 亚 门 (Mastigo- mycotin) ,卵菌纲(Oomycetes) ,霜霉目(Peronosporales)霜霉科(Peronosporaceae) ,霜霉属 (Peronospora) 。

　　4 技术原理

　　4. 1 检疫原理

　　烟草霜霉病菌为专性寄生菌 ,烟叶被侵染为害后 , 出现边缘模糊 、褪绿的近圆形斑点 ,后期形成淡褐色可脱落的坏死病斑 。在适宜温湿度条件下 , 叶背面病斑长出淡蓝色霉状物 , 即烟草霜霉病菌的孢囊梗和孢囊 ;在一定条件下 ,病组织内可形成卵孢子 。病原菌的寄生专化性及其形态学特征是鉴定烟草霜霉病的依据 。

　　4. 2 烟草霜霉病菌的鉴定特征

　　4. 2. 1 孢囊和孢囊梗的特征

　　烟草霜霉病菌的孢囊梗无色 ,从寄主气孔中伸出 ,主轴较粗壮 ,上部呈双叉分枝 3 次 ~ 10次 。孢囊梗长 400 μm~ 750 μm ,基部直径 10 μm~ 12 μm;分枝角度越分越大 ,末枝呈钝角分叉 ,叉枝基部略粗并向末端变尖 ,两叉枝长短略有差异 ,较长的一枝常弯曲 ,另一枝较直 ,末枝长 7 μm~ 14 μm;孢囊在末

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　　枝顶端同步形成 ,易脱落 ,无色或淡黄色 , 柠檬形或倒卵形 ,无乳头状突起 , 大小为(17 μm~ 28 μm) × (13μm~ 17μm) 。

　　4. 2. 2 卵孢子的特征

　　烟草霜霉病的卵孢子壁与藏卵器分离 。成熟卵孢子呈橘黄至红褐色 ,球形 ,直径为 20μm~ 60μm,外胞壁常有瘤状饰纹 。

　　5 仪器与试剂

　　5. 1 显微镜

　　放大倍数为 100倍 ~ 1 000倍 。

　　5. 2 双目解剖镜

　　放大倍数为 10倍 ~ 50倍 。

　　5. 3 电子天平

　　感量为 0. 1 g。

　　5. 4 离心机

　　转速为 1 000 r/min~4 000 r/min。

　　5. 5 不锈钢筛

　　孔径为 60 μm。

　　5. 6 振荡器

　　振速为 200 r/min。

　　5. 7 血球计数器

　　5. 8 苯胺蓝

　　5. 9 0. 02mol/L磷酸缓冲液(pH=7)

　　5. 10 乳酚油

　　乳酚油的配制 :液态苯酚 20 mL、乳酸 20 mL、甘油 40 mL、蒸馏水 20 mL混合而成 。 5. 11 10%氢氧化钾溶液

　　10%氢氧化钾溶液的配制 :取氢氧化钾 10. 0 g,加水 90 mL溶解 。

　　6 检疫程序与方法

　　6. 1 取样

　　6. 1. 1 种子

　　根据待检种子总件数按 5% ~ 20%取样 。在取样时 ,按对角线五点 、棋盘式或分层取样 , 每个取样

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　　点取样 10 g~ 20 g,然后混合均匀 。

　　注 : 旅客携带和国际邮包邮寄的少量烟草种子 ,取样量视具体情况而定 。

　　6. 1. 2 烟叶

　　不同产地 、不同等级的烟叶应分别取样 ,根据货物批量总件数抽取一定数量的样品 , 500件以下的抽查 20件 ,少于 20件的全批抽查 。在每件中抽取一定数量的带可疑病斑的烟叶作为代表性样品,充分混合后 ,按缩分法制备出两份样品,每份 1 kg~4 kg。一份为检验样品,另一份为备查样品 。按表 1 抽取样品份数 。

　　表 1 进境烟叶检疫抽查表 单位为件

　　批量总件数

　　抽查件数

　　500以下(含 500)

　　20

　　501~ 1 000

　　21~ 30

　　1 001~ 3 000

　　31~ 40

　　3 001~ 5 000

　　41~ 50

　　5001~ 10 000

　　51~ 70

　　10001以上

　　71~ 100

　　6. 1. 3 种苗

　　烟草种苗抽样每批按总件数的 5% ~ 20%抽查 ,每批取样检验 100株以上 ,少于 100株的全检 。

　　6. 2 孢子囊和孢囊梗检验

　　6. 2. 1 种子

　　从 6. 1. 1制备的烟草种子中随机抽取 5 g,放入三角瓶中 ,加蒸馏水以完全浸没烟草种子 ,浸泡 30 min,将三角瓶置于振荡器上振荡 5 min。将上层洗液转移至离心管 , 以 1000 r/min的速度离心 5 min,倾去上清液 ,每个离心管再加入适量蒸馏水 ,用手摇晃 ,使沉淀物重新悬浮在蒸馏水中 ,取几滴悬浮液涂于载玻片上 ,每个样品应制备 5个 ~ 10个载玻片 ,用显微镜(5. 1)在 400倍 ~ 500倍放大倍数下查看 ,检查每个载玻片 10个视野(见图 1)内的枝状孢子囊梗和孢子囊 。

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　　图 1 10个视野在载玻片上的分布

　　6. 2. 2 烟叶

　　6. 2. 2. 1 病叶检查

　　从 6. 1. 2制备的烟叶样品中随机抽取 1 kg,在光线充足处 ,逐片检查 ,迎光透视 ,可见明显病斑 ,若

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　　发现叶片背面病斑上有密生灰褐色霉层 ,则用显微镜进一步检验 。

　　6. 2. 2. 2 直接镜检

　　用解剖针挑取烟叶病斑上的霉状物涂在载玻片上 ,用显微镜在 400倍 ~ 500倍放大倍数下检查 ,观察病原菌的孢子囊梗和孢子囊 ,记录其形态特征 ,并测量孢子囊梗的长度和孢子囊的大小 ,测定数量应在 30个以上 。

　　6. 2. 2. 3 洗涤检验

　　剪下霜霉不明显的可疑病斑 ,用蒸馏水浸泡 30 min,待烟叶软化后 ,用振荡器振荡 5 min,将悬浮液注入离心管 , 以 1 000 r/ min的速度离心 5 min,然后倾去上层清液 ,每个离心管再加入适量蒸馏水 ,使沉淀物重新悬浮在蒸馏水中 ,取几滴悬浮液涂于载玻片上 ,每个样品应制备 5 个 ~ 10个载玻片 ,用 400倍 ~ 500倍显微镜观测 ,每个载玻片查看 10个视野(见图 1) ,检查树枝状孢子囊梗和孢子囊 。

　　6. 2. 3 种苗检验

　　检查种苗叶片背面霜霉病症状 ,用 6. 2. 2. 2 的方法镜检病原的孢囊梗和孢囊 。对可疑烟苗 ,应作保湿检查 :将可疑烟苗叶片展平 ,放入预制的直径为 15 cm~ 20 cm、铺有 3 层湿滤纸的培养皿中 ,加盖后形成小型湿室 ,置于 18 ℃环境中无光照诱发培养 12 h~ 24 h,然后在双目镜下仔细检查新生的烟草霜霉病的孢囊梗和孢囊 。

　　6. 3 卵孢子检验

　　6. 3. 1 种子

　　从 6. 1. 1制备的样品中随机抽取 5 g 烟草种子 ,置于烧杯中 ,加入 10%氢氧化钾水溶液以完全浸没烟草种子,煮沸 15 min~ 30 min,直至烟草种子透明 ,加苯胺蓝(5. 8)染色后用乳酚油(5. 10)作浮载剂 ,然后用显微镜检查 ,每个样品应检查 10个载玻片 。

　　6. 3. 2 烟叶

　　按 GB/T 18086—2000附录 A执行 。

　　6. 3. 3 孢子数量统计

　　用血球计数器统计孢子数量 ,观察 80个小格 ,计算 80小格内平均孢子数量 ,按式(1)计算每毫升悬浮液中孢子的数量 。

　　b=a × 4000 000 ……………………( 1 )

　　式中 :

　　b— 每毫升悬浮液中孢子的数量 ,单位为个 ;

　　a— 80小格内的平均孢子数量 ,单位为个 。

　　6. 4 种子萌发检验

　　6. 4. 1 检验方法

　　取 300 mL 的大口径三角瓶 4个 ,每瓶装入培养基 80 mL,用封口膜封住瓶 口 , 121 ℃ (120 kPa) 下灭菌 15 min。在无菌操作下 ,每瓶中撒播烟种子 100粒 , 15 ℃ ~ 20 ℃温箱内培养 。 待种子萌发后 , 观察烟苗上的霜霉病症状 。

　　检查种子内部病菌时 ,将种子浸入 1%次氯酸钠溶液 10 min,然后置于无菌滤纸上 ,培养检查 。

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　　6. 4. 2 结果统计

　　按式(2)计算单瓶发病率 ,按式(3)计算平均发病率 。

　　y ………………………………( 2 )

　　式中 :

　　y — 单瓶发病率 , 以百分数表示 ;

　　m— 单瓶内发病的烟苗数 ,单位为株 。

　　z ………………………………( 3 )

　　式中 :

　　z— 平均发病率 , 以百分数表示 ;

　　n —4瓶内发病的烟苗总数 ,单位为株 。

　　6. 5 隔离试种

　　6. 5. 1 检疫圃试种

　　初检合格 ,可以进入检疫圃的供检材料 ,在检疫温室用消毒过的土和盆进行育苗盆栽 。

　　6. 5. 2 隔离试种结果评定

　　在温室内对供检材料在整个生育期进行检查 ,详细登记检查结果并进行评定 。

　　7 检疫检验后的评定及处理

　　7. 1 种子、种苗

　　7. 1. 1 判定

　　经检疫未发现被检对象则认为合格 ,发现被检对象则认为不合格 。

　　7. 1. 2 处理

　　7. 1. 2. 1 合格的烟草种子、种苗的处理

　　7. 1. 2. 1. 1 发放检疫放行通知单

　　签发检疫放行通知单 ,或在货运单上加盖检疫放行章 。经严格包装 , 由专人送有资质的单位进行隔离试种检疫 。

　　7. 1. 2. 1. 2 国内试种

　　经隔离试种后未检出被检对象的 ,交送检人(单位)在国内试种 。

　　7. 1. 2. 2 不合格的烟草种子、种苗的处理

　　7. 1. 2. 2. 1 签发检疫处理通知

　　签发检疫处理通知单 。

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　　GB/T 15699—2013

　　7. 1. 2. 2. 2 销毁

　　应在检疫地原地销毁 。

　　7. 1. 2. 2. 3 处理后隔离试种

　　对于少量有价值的种子 ,可进行热处理后在检疫温室试种 。

　　热处理过程如下 :种子在 60 ℃下通风 2 h~ 3 h,充分干燥后平摊开 ,厚度小于 2 cm ,用干热消毒器在 70 ℃下处理 2 天以上 。

　　干热处理后的种子在检疫温室用无菌土 、盆试种 ,若烟苗未感染霜霉病菌 ,可将繁殖后的种子交送检人(单位) ,在国内试种 。

　　7. 2 烟叶

　　7. 2. 1 判定

　　经检疫未发现被检对象则认为合格 ,发现被检对象则认为不合格 。

　　7. 2. 2 处理

　　对于合格烟叶 ,应签发检疫放行通知单 ,或在货运单上加盖检疫放行章 ;对于不合格烟叶 ,该批烟叶不应入境 。

　　8 发放检疫证书

　　入境烟草种子 、种苗和烟叶没有发现检疫对象时 ,签发植物检疫证书 ;经检疫不符合贸易合同规定时 ,签发检验证书 ,并制备保存该被检样品和检疫对象的标本 ,作为索赔依据 。

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　　010-68522006

　　2014年 1 月第一版

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　　书号 : 155066 · 1-47948

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