GB/T 14643.6-2009 工业循环冷却水中菌藻的测定方法 第6部分：铁细菌的测定 MPN法

　　ICS 7 1 . 040 . 40 G 76

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 14643 . 6—2009代替 GB/T 14643 . 6—1993

　　工业循环冷却水中菌藻的测定方法

　　第 6 部分：铁细菌的测定 MPN 法

　　Examination ofbacteria and algaein industrialcirculating cooling water—

　　Part6：Examination ofiron bacteria—MPN test

　　2009-05-18 发布 2010-02-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 14643 . 6—2009

　　前 言

　　GB/T 14643《工业循环冷却水中菌藻的测定方法》分为以下几个部分：

　　— 第 1 部分：黏液形成菌的测定 平皿计数法

　　— 第 2 部分：土壤菌群的测定 平皿计数法

　　— 第 3 部分：黏泥真菌的测定 平皿计数法

　　— 第 4 部分：土壤真菌的测定 平皿计数法

　　— 第 5 部分：硫酸盐还原菌的测定 MPN 法

　　— 第 6 部分：铁细菌的测定 MPN 法

　　本部分为 GB/T 14643 的第 6 部分 。

　　本部分代替 GB/T 14643 . 6—1993《工业循环冷却水中铁细菌的测定 MPN 法》。

　　本部分 与 GB/T 14643 . 6—1993 相 比，在 技 术 内 容 上 并 无 变 化，只 是 对 文 本 结 构 和 文 字 进 行 了修改 。

　　本部分的附录 A 、附录 B 、附录 C 为规范性附录 。

　　本部分由中国石油和化学工业协会提出 。

　　本部分由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会(SAC/TC 63/SC 5)归 口 。

　　本部分负责起草单位：中海油天津化工研究设计院 、天津正达科技有限责任公司 。

　　本部分主要起草人：朱传俊 、张全 、邵宏谦 。

　　本部分于 1993 年首次发布 。

　　Ⅰ

　　GB/T 14643 . 6—2009

　　工业循环冷却水中菌藻的测定方法

　　第 6 部分：铁细菌的测定 MPN 法

　　1 范围

　　GB/T 14643 的本部分规定了工业循环冷却水中铁细菌的测定方法 。

　　本部分适用于工业循环冷却水中铁细菌的测定，也适用于原水 、生活用水及粘泥中铁细菌的测定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过 GB/T 14643 的本部分的引用而成为本部分的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否 可 使 用 这 些 文 件 的 最 新 版 本 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本 适 用 于 本部分 。

　　GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备(GB/T 603—2002 , ISO 6353-1 : 1982 , NEQ)

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682—2008 , ISO 3696:1987 , MOD)

　　3 方法提要

　　本法采用多试管发酵技术，在(29±1) ℃培养 14 d ,如果试管内棕色消失而且形成褐色或黑色沉淀，表明阳性反应，采用 MPN 技术，对被测试样中的铁细菌进行计数 。

　　4 试剂和材料

　　本部分所用试剂，除非另有规定，应使用分析纯试剂和符合 GB/T 6682 中三级水的规定 。

　　试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按 GB/T 603 之规定制备 。

　　4 . 1 硫酸镁 。

　　4 . 2 硫酸铵 。

　　4 . 3 磷酸氢二钾 。

　　4 . 4 氯化钙 。

　　4 . 5 硝酸钠 。

　　4 . 6 柠檬酸铁铵 。

　　4 . 7 氯化钠 。

　　4 . 8 氢氧化钠溶液：40 g/L 。

　　4 . 9 盐酸溶液：1+11 。

　　4 . 10 硫代硫酸钠 。

　　4 . 1 1 乙醇溶液：75%(体积分数)。

　　4 . 12 牛皮纸 。

　　4 . 13 医用脱脂棉 。

　　5 仪器 、设备

　　5 . 1 无菌箱(室)或超净工作台 。

　　5 . 2 蒸汽压力灭菌器 。

　　5 . 3 生化培养箱 。

　　1

　　GB/T 14643 . 6—2009

　　5 . 4 电热干燥箱：温度可控制在 60 ℃ ~ 280 ℃ 。

　　5 . 5 刻度吸管：1 mL 。

　　5 . 6 刻度吸管：5 mL 。

　　5 . 7 试管：150 mm×15 mm 。

　　5 . 8 试管架 。

　　5 . 9 磨口三角瓶：100 mL 。

　　5 . 10 磨口试剂瓶：1 000 mL 。

　　5 . 1 1 容量瓶：1 000 mL 。

　　6 试验前准备

　　6 . 1 培养基的制备称取下列试剂：

　　硫酸镁 0 . 5 g ;

　　硫酸铵 0 . 5 g ;

　　磷酸氢二钾 0 . 5 g ;

　　氯化钙 0 . 2 g ;

　　硝酸钠 0 . 5 g ;

　　柠檬酸铁铵 10 . 0 g 。

　　将上述试剂溶解在 1 000 mL水中，用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节 pH 至 6 . 8 ± 0 . 2 ,并分装在试管中，每管 5 mL,塞上棉塞，数支一捆，每捆管口用牛皮纸包扎，用蒸汽压力灭菌器于(121±1) ℃灭菌

　　15 min 。

　　6 . 2 无菌稀释水的制备

　　6 . 2 . 1 生理盐水的配制：称取 8 . 5 g 氯化钠溶解在 1 000 mL水中，混匀 。

　　6 . 2 . 2 将生理盐水分装在 100 mL磨口三角瓶中，每瓶 45 mL 。每个三角瓶塞子和瓶 口 间插入一小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器于(121±1) ℃灭菌 15 min 。

　　6 . 3 刻度吸管的灭菌

　　6 . 3 . 1 将洗净并烘干后的刻度吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约 10 mm ~ 15 mm,棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉 。

　　6 . 3 . 2 每支刻度吸管用一条约 40 mm ~ 50 mm 宽的牛皮纸条，以 45 °左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端用多余的纸条折叠打结，不使散开，标上度量，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于(160±2) ℃灭菌 2 h 。

　　6 . 4 采样瓶的灭菌

　　将洗净并烘干后的 1 000 mL 磨 口 试 剂 瓶 瓶 口 和 瓶 颈 用 牛 皮 纸 裹 好，扎 紧，置 电 热 干 燥 箱 中，于(160±2) ℃灭菌 2 h 。

　　6 . 5 硫代硫酸钠灭菌

　　将硫代硫酸钠放入无菌箱(室)内，并均匀地摊在离紫外线灯 30 cm处，灭菌 30 min 。

　　7 测定步骤

　　7 . 1 水样的采集

　　7 . 1 . 1 用无菌采样瓶采集被测样品，在采样过程中，要保护瓶口和颈部，防止这些部分受杂菌污染，瓶内要留下足够的空间，以备测定之前摇匀 。

　　7 . 1 . 2 若采集的水中有余氯，应在采样前，在无菌操作下，于无菌采样瓶中加入灭过菌的硫代硫酸钠，加入的量为每升水样约 0 . 1 g 。

　　7 . 1 . 3 水样采集后应立即进行测定，如果在 2 h 内不能进行测定，应把水样放在冰箱中于 4 ℃ ~ 10 ℃

　　2

　　GB/T 14643 . 6—2009

　　保存，存放时间不宜超过 24 h 。经冷冻保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，于 30 ℃左右活化 4 h ~ 5 h ,再进行测定 。

　　7 . 2 无菌箱(室)灭菌

　　把试验所用的无菌培 养 基 、无 菌 稀 释 水 、无 菌 吸 管 等 用 品 放 入 无 菌 箱(室)内，打 开 紫 外 线 灯 灭 菌

　　30 min 。

　　7 . 3 水样的稀释和接种

　　7 . 3 . 1 水样放入灭过菌的无菌箱(室)中，立即用 75%乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点燃无菌箱(室)内的酒精灯 。

　　对水样的稀释和接种的操作应在无菌箱(室)内的火焰区进行 。

　　7 . 3 . 2 选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种培养后无铁细菌生长，在空白稀释水样瓶上标上稀释度数 。

　　7 . 3 . 3 用 10 倍稀释法稀释水样，即用 5 mL无菌吸管吸取 5 mL水样注入到 45 mL 空白稀释水中充分摇匀，此时稀释度为 10 - 1 。

　　7 . 3 . 4 另取一支 5 mL无菌吸管吸取 5 mL稀释度为 10-1 水样注入到第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为 10 - 2 , 依次类推，直至需要的稀释度为止 。

　　7 . 3 . 5 将水样(包括稀释水样)分别接种于装有培养基的试管中，试管置试管架上，每个稀释度重复接种 5 管(根据需要也可重复接种 3 管或 4 管)，每管接种 1 mL,每接一个稀释度更换一支无菌吸管 。

　　7 . 3 . 6 另取一组试管培养基不接水样，作为空白 。

　　7 . 4 培养

　　在生化培养箱中于(29±1) ℃培养 14 d 。

　　8 计数与报告

　　8 . 1 凡产生褐色或黑色沉淀且原培养基中棕色消失变为透明状者，表明有铁细菌存在，以 “+ ”(阳性)表示，其余试管以“- ”(阴性)表示 。

　　8 . 2 如果空白出现阳性反应，表明测定过程中有污染，本次测定无效 。

　　8 . 3 算出 10 进位稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录下来 。

　　8 . 4 在 10 进位稀释中多于三个稀释度时，阳性组合的指数只需要用其中依次的三个稀释度，对这三个稀释度的决定是先选出 5 管全部阳性反应的最大稀释度，然后选出其次相连的两个更高的稀释度，算出阳性组合指数(见表 1 示例 1 、2 、4) 。

　　8 . 5 若按照 8 . 4 所规定的原则选出三个稀释度后，有更高的稀释仍然产生一个阳性试管，就应该将这一个阳性试管并入所选择的最高稀释的阳性结果中(见表 1 示例 3) 。

　　8 . 6 根据阳性组合的指数，查表 A. 1 得出最大可能的菌数( MPN) 除以阳性组合指数的第一位数字的稀释度数，即为每毫升水样中铁细菌的菌数(如果每个稀释度重复接种 4 管或 3 管，根据阳性组合的指数查 “附录 B”表 B. 1 或 “附录 C”表 C. 1) 。

　　表 1

　　示 例

　　稀释度 、生长情况及阳性试管数

　　阳性组合指数

　　报告方式

　　个/mL

　　100

　　10 - 1

　　10 - 2

　　10 - 3

　　10 - 4

　　1

　　+ + + + +

　　5

　　+ + + + +

　　5

　　+ + ---

　　2

　　-----

　　0

　　-----

　　0

　　520

　　5 . 0/10 - 1 = 50

　　2

　　+ + + + +

　　5

　　+ + + + -

　　4

　　+ + ---

　　2

　　-----

　　0

　　-----

　　0

　　542

　　25/100 = 25

　　3

　　+ + + + +

　　5

　　+ + + --

　　3

　　+ ----

　　1

　　+ ----

　　1

　　-----

　　0

　　532

　　14/100 = 14

　　4

　　+ + + + +

　　5

　　+ + + + +

　　5

　　+ + + + +

　　5

　　+ ----

　　1

　　-----

　　0

　　510

　　3 . 5/10 - 2 = 3 . 5 × 10 2

　　3

　　GB/T 14643 . 6—2009

　　9 精密度

　　9 . 1 由于微生物是不稳定的，精确的试验不能实现，精密度的表达仅能按 MPN 程序 。

　　9 . 2 在样品中细菌的分布是不规则的，有时细菌成倍地吸附到小颗粒上，MPN 正确度随着平行管的增加而增加，当使用 5 个平行管，每管加 1 mL样品时，测定结果的置信度为 95% 。

　　4

　　GB/T 14643 . 6—2009

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　五个平行管最大可能的菌数

　　五个平行管最大可能的菌数见表 A. 1 。

　　表 A.1

　　指数

　　个/mL

　　指数

　　个/mL

　　指数

　　个/mL

　　指数

　　个/mL

　　000

　　0 . 0

　　203

　　1 . 2

　　400

　　1 . 3

　　513

　　8 . 5

　　001

　　0 . 2

　　210

　　0 . 7

　　401

　　1 . 7

　　520

　　5 . 0

　　002

　　0 . 4

　　211

　　0 . 9

　　402

　　2 . 0

　　521

　　7 . 0

　　010

　　0 . 2

　　212

　　1 . 2

　　403

　　2 . 5

　　522

　　9 . 5

　　011

　　0 . 4

　　220

　　0 . 9

　　410

　　1 . 7

　　523

　　12 . 0

　　012

　　0 . 6

　　221

　　1 . 2

　　411

　　2 . 0

　　524

　　15 . 0

　　020

　　0 . 4

　　222

　　1 . 4

　　412

　　2 . 5

　　525

　　17 . 5

　　021

　　0 . 6

　　230

　　1 . 2

　　420

　　2 . 0

　　530

　　8 . 0

　　030

　　0 . 6

　　231

　　1 . 4

　　421

　　2 . 5

　　531

　　11 . 0

　　100

　　0 . 2

　　240

　　1 . 4

　　422

　　3 . 0

　　532

　　14 . 0

　　101

　　0 . 4

　　300

　　0 . 8

　　430

　　2 . 5

　　533

　　17 . 0

　　102

　　0 . 6

　　301

　　1 . 1

　　431

　　3 . 0

　　534

　　20 . 0

　　103

　　0 . 8

　　302

　　1 . 4

　　432

　　4 . 0

　　535

　　25 . 0

　　110

　　0 . 4

　　310

　　1 . 1

　　440

　　3 . 5

　　540

　　13 . 0

　　111

　　0 . 6

　　311

　　1 . 4

　　441

　　4 . 9

　　541

　　17 . 0

　　112

　　0 . 8

　　312

　　1 . 7

　　450

　　4 . 0

　　542

　　25 . 0

　　120

　　0 . 6

　　313

　　2 . 0

　　451

　　5 . 0

　　543

　　30 . 0

　　121

　　0 . 8

　　320

　　1 . 4

　　500

　　2 . 5

　　544

　　35 . 0

　　122

　　1 . 0

　　321

　　1 . 7

　　501

　　3 . 0

　　545

　　45 . 0

　　130

　　0 . 8

　　322

　　2 . 0

　　502

　　4 . 0

　　550

　　25 . 0

　　131

　　1 . 0

　　330

　　1 . 7

　　503

　　6 . 0

　　551

　　35 . 0

　　141

　　1 . 1

　　331

　　2 . 0

　　504

　　7 . 5

　　552

　　60 . 0

　　200

　　0 . 5

　　340

　　2 . 0

　　510

　　3 . 5

　　553

　　90 . 0

　　201

　　0 . 7

　　341

　　2 . 5

　　511

　　4 . 5

　　554

　　160 . 0

　　202

　　0 . 9

　　350

　　2 . 5

　　512

　　6 . 0

　　555

　　180 . 0

　　5

　　GB/T 14643 . 6—2009

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　四个平行管时最大可能菌数

　　四个平行管时最大可能菌数见表 B. 1 。

　　表 B.1

　　指数

　　个/mL

　　指数

　　个/mL

　　指数

　　个/mL

　　指数

　　个/mL

　　000

　　0 . 0

　　113

　　1 . 3

　　231