GB/T 41556-2022 牛巴贝斯虫病诊断技术

　　ICS 1 1 . 220 CCS B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 41556—2022

　　牛巴贝斯虫病诊断技术

　　DiagnostictechniquesforbovineBabesiainfection

　　2022-07-1 1 发布 2023-02-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 41556—2022

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国农业农村部提出。

　　本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口 。

　　本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。

　　本文件主要起草人：殷宏、关贵全、刘爱红、刘军龙、罗建勋。

　　Ⅰ

　　GB/T 41556—2022

　　牛巴贝斯虫病诊断技术

　　1 范围

　　本文件规定了牛巴贝斯虫(Babesiabo℃is)和双芽巴贝斯虫(Babesiabigemina)的检测技术及牛巴

　　贝斯虫病的诊断技术要求。

　　本文件适用于牛巴贝斯虫病病原检测、核酸检测、抗体检测及牛巴贝斯虫病的诊断。

　　注：本文件所称牛巴贝斯虫病为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫单独或混合感染引起的牛的巴贝斯虫病。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)

　　dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside triphosphate)

　　EB：溴化乙锭(Ethidium bromide)

　　ELISA：酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay)

　　HRP：辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)

　　IgG：免疫球蛋白 G(Immunoglobulin G)

　　IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)

　　ITS：内转录间隔区 (Internal transcribed spacer)

　　PBS：磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline)

　　PBST：磷酸盐吐温缓冲液(Phosphate buffered saline Tween)

　　PCR：聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)

　　RAP-1：棒状体相关蛋白-1(Rhoptry associated protein-1)

　　TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸(Tris-acetate-EDTA)

　　TMB: 3 , 3 ′, 5 , 5 -四甲基联苯胺(3 , 3 ′, 5 ,5′-Tetramethyl benzidine)

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　　5 材料和试剂

　　5 . 1 试剂

　　5 . 1 . 1 除特别规定外，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T6682 的要求。

　　5 . 1 . 2 姬姆萨染色液原液，按照附录 A 中 A. 1 方法配制。

　　5 . 1 . 3 姬姆萨染色液工作液，按照 A. 2 方法配制。

　　5 . 1 . 4 甲醇 。

　　5 . 1 . 5 香柏油 。

　　5. 1 .6 2 × Premix Taq酶混合液(商品化)包含 DNA 聚合酶、缓冲液和 2.5 m mol/L 的 dNTP混合物。

　　5. 1 .7 无 RNase水。

　　5 . 1 . 8 全血基因组 DNA提取试剂盒。

　　5 . 1 . 9 琼脂糖(电泳级)。

　　5. 1 . 10 1×TAE缓冲液，按照 A.3 方法配制。

　　5. 1 . 1 1 10 mg/mL溴化乙锭(EB) ,按照 A. 4 的方法配制，或同类核酸染料。

　　5 . 1 . 12 牛巴贝斯虫阳性基因组对照(用牛巴贝斯虫感染牛，染虫率达到 5%以上时，采集抗凝血，提取血液基因组 DNA,稀释至 1 ng/μL;或序列合成基因片段(见附录 B 中 B.1)作为阳性对照。

　　5 . 1 . 13 双芽巴贝斯虫阳性基因组对照(用双芽巴贝斯虫感染牛，染虫率达到 5%以上时，采集抗凝血，提取血液基因组 DNA,稀释至 1 ng/μL;或序列合成基因片段(见 B.2)作为阳性对照。

　　5. 1 . 14 巴贝斯虫阴性基因组对照(筛选巴贝斯虫阴性牛，提取血液基因组 DNA,稀释至 1 ng/μL)。

　　5. 1 . 15 核酸分子 Marker。

　　5 . 1 . 16 辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛 IgG抗体。

　　5 . 1 . 17 TMB底物溶液。

　　5 . 1 . 18 包被液、稀释液、封闭液、洗涤液和终止液，按照附录 A 的方法配制。

　　5 . 2 耗材

　　5 . 2 . 1 载玻片 。

　　5 . 2 . 2 抗凝真空采血管。

　　5 . 2 . 3 剪毛剪 。

　　5.2.4 1.5 mL无菌离心管。

　　5.2.5 200 μL PCR管。

　　5 . 2 . 6 各种规格的微量移液器吸头。

　　5 . 2 . 7 96 孔 ELISA板 。

　　5 . 2 . 8 一次性封板膜。

　　5 . 3 仪器

　　5 . 3 . 1 光学显微镜(含 100×物镜)。

　　5 . 3 . 2 PCR扩增仪。

　　5 . 3 . 3 核酸电泳系统。

　　5 . 3 . 4 凝胶成像仪。

　　5.3.5 单道微量移液器(1 μL~10 μL; 10 μL~100 μL; 100 μL~1 000 μL)。

　　5.3.6 8 道或 12 道微量移液器(50 μL~300 μL)。

　　5 . 3 . 7 离心机 。

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　　5 . 3 . 8 高压蒸汽灭菌器。

　　5 . 3 . 9 酶标仪 。

　　5 . 3 . 10 恒温箱 。

　　5 . 3 . 1 1 核酸蛋白检测仪。

　　6 生物安全要求

　　样品采集、处理及检测过程中涉及的实验操作，应遵守 GB 19489 和 GB/T 27401 的相关规定。

　　7 临床诊断

　　7 . 1 典型临床症状

　　7 . 1 . 1 体温升高到 40 ℃ ~42 ℃ ,呈稽留热型。

　　7 . 1 . 2 贫血，可视黏膜苍白或黄染(见附录 C 图 C. 1 中 ①) 。

　　7 . 1 . 3 血红蛋白尿，尿液呈棕红色至酱油色。

　　7 . 1 . 4 牛巴贝斯虫感染时，会表现较严重的神经症状。

　　7 . 2 典型病理变化

　　7 . 2 . 1 血液稀薄如水，凝固不良。

　　7 . 2 . 2 皮下组织、肌间结缔组织和脂肪呈胶样浸润黄染(见图 C. 1 中 ②) 。

　　7 . 2 . 3 皱胃和肠黏膜潮红并有点状出血。

　　7 . 2 . 4 实质性脏器肿大、出血、黄染或呈深棕色(见图 C. 1 中 ③④⑤) 。

　　7 . 2 . 5 膀胱膨大，贮存尿液深棕色(见图 C. 1 中 ⑥) 。

　　7 . 3 流行特点

　　7 . 3 . 1 患病动物有蜱叮咬史，该病主要发生在微小扇头蜱(微小牛蜱)(见附录 D 中图 D. 1)分布的区域。

　　7 . 3 . 2 一年之内可以暴发 2~3 次，多发生于 4 月 ~10 月，呈散发。

　　7 . 3 . 3 两岁以内的犊牛多发;本地牛症状轻微，引进牛、纯种牛和改良牛常表现明显临床症状。

　　7 . 4 结果判定

　　牛只出现 7 . 1 临床症状或剖检时有 7 . 2 病理变化，并符合 7 . 3 的流行特点，判为疑似牛巴贝斯虫病。

　　8 血涂片显微镜镜检

　　8 . 1 血涂片制备

　　用剪毛剪剪去牛耳尖牛毛，针头刺破耳尖，挤取一滴耳尖静脉血于载玻片上，用推片将血液推成薄血涂片，并迅速晾干。

　　8 . 2 血涂片固定

　　加甲醇于血涂片上进行固定，使甲醇完全覆盖血涂层，待晾干后重复一次。

　　8 . 3 血涂片染色

　　在固定好的血涂片上滴加姬姆萨染色液工作液，使染色液完全覆盖血涂层。 室温染色 30 min,用

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　　自来水冲洗掉染色液，自然晾干或用吹风机吹干待检。

　　8 . 4 显微镜镜检

　　在染色好的血涂片上滴加一滴香柏油，用光学显微镜在 100×物镜下观察 100 个视野。

　　8 . 5 结果判定

　　8 . 5 . 1 阳性

　　红细胞内观察到巴贝斯虫典型虫体(见附录 E 中图 E. 1 和图 E. 2)时，判为血涂片显微镜镜检阳性。

　　8 . 5 . 2 疑似阳性

　　红细胞内未见典型虫体，但观察到少量点状、较大的圆形单个疑似虫体时，判为血涂片显微镜镜检疑似阳性。

　　8 . 5 . 3 阴性

　　未出现 8 . 5 . 1 和 8 . 5 . 2 的结果，判为血涂片显微镜镜检阴性。

　　9 牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫 PCR检测方法

　　9 . 1 样品处理

　　采集牛静脉抗凝血于密闭塑料离心管中，编号，4 ℃保存，送检。

　　9 . 2 DNA提取

　　用商品化的血液基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA, 方法按照试剂盒说明书。 提取的DNA立刻进行 PCR扩增或-20 ℃保存备用。

　　9 . 3 PCR反应操作方法

　　9 . 3 . 1 反应体系

　　用引物 BoF/ BoR 和 BbF/BbR,按照附录 F 中表 F. 1 引物序列合成。 配制 PCR 反应体系，按照附录 G 中 表 G. 1 配 制，反 应 体 系 为 25 μL。 牛 巴 贝 斯 虫 阳 性 DNA 为 牛 巴 贝 斯 虫 阳 性 基 因 组 对 照(5 . 1 . 12),双芽巴贝斯虫阳性 DNA 为双芽巴贝斯虫基因组对照(5 . 1 . 13),阴性对照为巴贝斯虫阴性牛血液基因组(5 . 1 . 14) 。

　　9 . 3 . 2 反应条件

　　于 200 μLPCR管中配制反应体系，混匀，置 PCR仪中进行扩增。 扩增程序为：95 ℃预变性 5 min;然后 92 ℃变性 1 min, 56 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min,共扩增 35 个循环;72 ℃延伸 10 min。

　　9 . 3 . 3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳和成像

　　用 1×TAE缓冲液配制 1 . 5%琼脂糖凝胶，取 PCR产物 10 μL 与 2 μL 6×加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭或同类核酸染料的 1 . 5%琼脂糖凝胶制备的凝胶块中。 在 1×TAE缓冲液中，5 V/ cm 电泳约 30 min, 当溴酚蓝到达底部时停止电泳，凝胶成像分析系统观察结果，并拍照保存。

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　　9 . 3 . 4 质控标准

　　9 . 3 . 4 . 1 牛巴贝斯虫特异性引物扩增

　　牛巴贝斯虫阳性 DNA对照出现大小为 408 bp 的特异性条带，且双芽巴贝斯虫阳性 DNA 和阴性对照无扩增条带时，判为试验成立(按附录 H 中图 H . 1) 。

　　9 . 3 . 4 . 2 双芽巴贝斯虫特异性引物扩增

　　双芽巴贝斯虫阳性 DNA对照出现大小为 646 bp 的特异性条带，且牛巴贝斯虫阳性 DNA 和巴贝斯虫阴性牛血液 DNA对照无扩增条带时，判为试验成立(按图 H . 2) 。

　　9 . 4 结果判定

　　9 . 4 . 1 阳性

　　9 . 4 . 1 . 1 牛巴贝斯虫核酸阳性

　　用牛巴贝斯虫特异性引物自待检样品基因组 DNA 中扩增出大小为 408 bp 的条带，且用双芽巴贝斯虫特异性引物未扩增出条带时，判定为牛巴贝斯虫核酸阳性(按图 H . 3) 。

　　9 . 4 . 1 . 2 双芽巴贝斯虫核酸阳性

　　用双芽巴贝斯虫特异性引物自待检样品基因组 DNA 中扩增出大小为 646 bp 的条带，且用牛巴贝斯虫特异性引物未扩增出条带时，判定为双芽巴贝斯虫核酸阳性(按图 H . 4) 。

　　9 . 4 . 1 . 3 牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫核酸双阳性

　　用牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫特异性引物从待检样品基因组 DNA 中分别扩增出大小为 408 bp 和646 bp 的条带时，判为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫核酸双阳性(按图 H . 5) 。

　　9 . 4 . 2 阴性

　　样品无特异性的阳性扩增条带出现，判定为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫核酸阴性。

　　10 牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫 ELISA抗体检测方法

　　10 . 1 材料准备

　　牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫棒状体相关蛋白-1(RAP-1)C端重组抗原按照附录 I制备，巴贝斯虫标准阴性对照血清按照附录 J 制备，牛巴贝斯虫和双芽贝斯虫标准阳性对照血清按照附录 K 制备。 其他相关试剂按照附录 A配制。

　　10 . 2 待检血清样品的处理

　　静脉无菌采集牛血液，不少于 3 mL。 室温静置 2 h,待血液自然凝固后，于 2 ℃ ~8 ℃冰箱中放置2 h。4 ℃ 3 000g 离心 10 min,收集上清液，分装于 1 . 5 mL离心管，于 -20 ℃冰箱保存或送检。

　　10 . 3 操作步骤

　　10 . 3 . 1 抗原包被

　　用包被液将牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫 RAP-1 的 C端重组抗原分别稀释成质量浓度为 2 μg/mL

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　　GB/T 41556—2022

　　和 1 μg/mL,按 100 μL/孔加到 96 孔 ELISA板中，分别包被 ELISA 板，用封板膜封 口，置于 4 ℃冰箱

　　15 h。 翌 日，去掉封板膜，甩掉孔内液体，每孔加入 300 μL 洗涤液，洗涤 3 次，每次 1 min, 最后一次拍干。

　　10 . 3 . 2 封闭

　　每孔加入新鲜配制的封闭液 200 μL,用封板膜封口，37 ℃孵育 1 h(双芽巴贝斯虫)或 1 . 5 h(牛巴贝斯虫)。去掉封板膜，甩掉孔内液体，同 10 . 3 . 1 中的方法洗涤，最后一次拍干。

　　10 . 3 . 3 加入血清样品

　　将 10 . 2 处理的血清样品用稀释液按 1 ∶ 20 稀释，每孔加入 100 μL,设置 2 个重复。 同时每张板上设标准阳性对照、标准阴性对照和空白(稀释液)对照各 2 孔，用封板膜封 口，37 ℃孵育 1 h。 去掉封板膜，甩掉孔内液体，同 10 . 3 . 1 中的方法洗涤，最后一次拍干。

　　10 . 3 . 4 加入 HRP标记的兔抗牛 IgG抗体

　　用稀释液将 HRP标记的兔抗牛 IgG抗体稀释至工作浓度，每孔加入 100 μL,用封板膜封口，37 ℃孵育 1 h。 去掉封板膜，甩掉孔内液体，同 10 . 3 . 1 中的方法洗涤，最后一次拍干。

　　10 . 3 . 5 加入底物溶液

　　每孔加入 100 μL 的 TMB底物溶液，用封板膜封口，37 ℃避光作用 10 min。

　　10 . 3 . 6 加入终止液

　　每孔加入 100 μL 的终止液，终止反应。 混匀后立刻在酶标仪上读取 OD450 值 。

　　10 . 4 质控标准

　　标准阳性对照血清平均 OD450 值 >1 . 0,且标准阴性对照血清平均 OD450 值<0 . 4 时，试验结果成立。

　　10 . 5 结果判定

　　10.5. 1 s/p 值计算

　　按下式计算 s/P 值 ：

　　待检样品 OD450 平均值—标准阴性对照 OD450 平均值

　　s/P=标准阳性对照 OD450 平均值 — 标准阴性对照 OD450 平均值

　　10 . 5 . 2 阳性

　　10 . 5 . 2 . 1 牛巴贝斯虫血清抗体阳性

　　用牛巴贝斯虫 RAP-1 的 C端重组抗原包被的 ELISA板检测，待检样品 s/P 值 ≥0 . 28 时，判定为牛巴贝斯虫血清抗体阳性。

　　10 . 5 . 2 . 2 双芽巴贝斯虫血清抗体阳性

　　用双芽巴贝斯虫 RAP-1 的 C端重组抗原包被的 ELISA板检测，待检样品 s/P 值 ≥0 . 32 时，判定为双芽巴贝斯虫血清抗体阳性。

　　10 . 5 . 2 . 3 牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫血清抗体双阳性

　　用牛巴贝斯虫 RAP-1 的 C端重组抗原包被的 ELISA板检测时待检样品 s/P 值 ≥0 . 28,且用双芽

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　　GB/T 41556—2022

　　巴贝斯虫 RAP-1 的 C端重组抗原包被的 ELISA板检测时待检样品 s/P 值 ≥0.32,判定为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫血清抗体双阳性。

　　10 . 5 . 3 阴性

　　用牛巴贝斯虫 RAP-1 的 C端重组抗原包被的 ELISA板检测时待检样品 s/P 值 <0.28,且用双芽巴贝斯虫 RAP-1 的 C端重组抗原包被的 ELISA板检测时待检样品 s/P 值<0.28,判定为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫血清抗体阴性。

　　1 1 综合判定

　　1 1 . 1 阳性

　　出现 7 . 4 疑似巴贝斯虫病特征，进一步判定如下：

　　a) 出现 8 . 5 . 1 结果的，判为牛巴贝斯虫病阳性;

　　b) 出现 9 . 4 . 1 . 1 或 10 . 5 . 2 . 1 结果的，判为牛巴贝斯虫感染引起的牛巴贝斯虫病阳性;

　　c) 出现 9 . 4 . 1 . 2 或 10 . 5 . 2 . 2 结果的，判为双芽巴贝斯虫感染引起的牛巴贝斯虫病阳性;

　　d) 出现 9 . 4 . 1 . 3 或 10 . 5 . 2 . 3 结果的，判为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫混合感染引起的牛巴贝斯虫病阳性。

　　1 1 . 2 隐性感染

　　未出现 7 . 4 疑似巴贝斯虫病特征，进一步判定如下：

　　a) 出现 8 . 5 . 1 结果的，判为牛巴贝斯虫或双芽巴贝斯虫隐性感染;

　　b) 出现 9 . 4 . 1 . 1 或 10 . 5 . 2 . 1 结果的，判为牛巴贝斯虫隐性感染 ;

　　c) 出现 9 . 4 . 1 . 2 或 10 . 5 . 2 . 2 结果的，判为双芽巴贝斯虫隐性感染 ;

　　d) 出现 9 . 4 . 1 . 3 或 10 . 5 . 2 . 3 结果的，判为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫隐性混合感染。

　　1 1 . 3 阴性

　　未出现 7 . 4 疑似巴贝斯虫病特征，进一步判定如下：

　　a) 出现 8 . 5 . 2、9 . 4 . 2 和 10 . 5 . 3 结果的，判为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫感染阴性，即牛巴贝斯虫病阴性;

　　b) 出现 8 . 5 . 3、9 . 4 . 2 和 10 . 5 . 3 结果的，判为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫感染阴性，即牛巴贝斯虫病阴性。

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　　附 录 A

　　(规范性)

　　标准中涉及的试剂配制方法

　　A.1 姬姆萨染色液原液

　　准备 33 mL甘油。 将 0 . 5 g姬姆萨染料置于研钵中，加少量甘油进行充分研磨，然后加入全部的甘油，55 ℃ ~60 ℃水浴加热 1 h~2 h,期间不断摇动混匀。 冷却至室温后加入 33 mL 甲醇，搅拌混匀，储存在棕色瓶中室温静置 6~12 个月，过滤备用。

　　A.2 姬姆萨染色液工作液

　　按每毫升去离子水加 200 μL姬姆萨染色液原液进行配制。

　　A.3 TAE缓冲液的配制

　　A.3 . 1 50×TAE贮存液

　　Na2 EDTA ·2H2 O 37.2 g

　　冰醋酸 57.1 mL

　　Tris-Base 242 g

　　用约 800 mL灭菌去离子水溶解，充分混匀后用灭菌去离子水补齐至 1 000 mL,常温保存备用。

　　A.3 . 2 1 ×TAE使用液

　　50×TAE贮存液 10 mL

　　去离子水 490 mL

　　混匀，常温保存备用。

　　A.4 10 mg/mL溴化乙锭

　　称取溴化乙锭 1 g,加去离子水定容至 100 mL, 磁力搅拌充分溶解后，转移至棕色瓶内室温避光保存。

　　A.5 1 . 5%的琼脂糖凝胶

　　琼脂糖干粉 1 . 5 g

　　1×TAE使用液 100 mL

　　微波炉加热至琼脂糖熔化，待稍冷却后加入终浓度为 0 . 5 μg/mL溴化乙锭或同类核酸染料，摇匀。

　　A.6 包被液(PH 9.6 ,0.05 mol/L碳酸盐缓冲液)

　　NaHCO3 2.93 g

　　Na2 CO3 1.5 g

　　去离子水 900 mL

　　完全溶解后，调 pH 值至 9 . 6,加去离子水至 1 000 mL,用 0 . 45 μm 的一次性针头滤器过滤除菌，室温保存备用。

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　　GB/T 41556—2022

　　A.7 稀释液(PH 7.4 , PBS)

　　NaCl

　　40 g

　　KCl

　　1 g

　　KH 2 PO4

　　1 g

　　Na2 HPO4 ·12H 2 O

　　17 . 9 g

　　去离子水

　　4 .9 L

　　完全溶解后，调 pH 值至 7 . 4,加去离子水至 5 L,混匀，常温保存备用。

　　A.8 洗涤液(PH 7.4 ,0.0 1 mol/LPBST)

　　PBS(pH 7.4) 999.5 mL

　　吐温-20 0.5 mL

　　混匀，常温保存备用。

　　A.9 封闭液

　　脱脂奶粉 5 g

　　PBST 100 mL

　　完全溶解，现用现配。

　　A.10 终止液(2 mol/LH2So4)

　　浓 H2 SO4 11.1 mL

　　去离子水 88 . 9 mL

　　将浓 H 2 SO4 缓慢加入到去离子水中，混匀，冷却至室温。

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫 PCR扩增片段核酸序列

　　B.1 牛巴贝斯虫内转录间隔区(ITS)目的基因片段序列

　　B.2 双芽巴贝斯虫内转录间隔区(ITS)目的基因片段序列

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　牛巴贝斯虫病典型病理变化

　　牛巴贝斯虫病典型病理变化见图 C. 1 。

　　标引序号说明：

　　① —可视黏膜黄染;

　　② —皮下组织、肌间结缔组织和脂肪组织黄染;

　　③ —肝脏肿大、黄染;

　　④ —脾脏肿大;

　　⑤ — 肾脏深棕色;

　　⑥ —膀胱内尿液呈深棕色。

　　注：引 自 Pupin RC, et al. , 2019。

　　图 C.1 牛巴贝斯虫病典型病理变化图

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　　附 录 D

　　(资料性)

　　牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫传播媒介微小扇头蜱(微小牛蜱)鉴定特征

　　D.1 鉴定要点

　　雌蜱：体型小。 假头基六角形。 须肢粗短，第 Ⅱ 、Ⅲ节有横脊。 盾板显著长胜于宽，后侧缘微波状，后角窄钝;无刻点。 无缘沟及缘垛。 基节 Ⅰ 亚三角形，内外距均粗短而圆钝。 气门板长圆形。

　　雄蜱：体型小。 假头基六角形。 须肢粗短，第 Ⅱ 、Ⅲ节有横脊。 无侧沟和缘垛;尾突明显，末端尖细。具肛侧板和副肛侧板，无肛下板。 气门板长圆形。

　　D.2 微小扇头蜱雌蜱和雄蜱形态

　　微小扇头蜱雌蜱和雄蜱的形态特征见图 D. 1 。

　　标引序号说明：

　　① —雌蜱背面;

　　② —雄蜱背面;

　　③ —雌蜱假头背面;

　　④ —雄蜱假头背面。

　　注：引 自 Roy BC, et al. , 2018。

　　图 D.1 微小扇头蜱雌蜱和雄蜱形态图

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　　附 录 E

　　(资料性)

　　牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫典型虫体形态

　　E.1 红细胞内的牛巴贝斯虫形态

　　牛红细胞内的牛巴贝斯虫典型虫体形态见图 E. 1,箭头所示为红细胞内典型的牛巴贝斯虫双梨籽形虫体形态。