GB/T 43169-2023 马铃薯斑纹病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 20 CCS B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 43169—2023

　　马铃薯斑纹病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification of candidatus Liberibacter solanacearum

　　2023-09-07 发布 2024-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 43169—2023

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分:标准化文件的结构和起草原则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 。

　　本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院 、广州海关技术中心 、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心 、满洲里海关技术中心 、中华人民共和国银川海关 。

　　本文件主要起草人:魏霜 、丁钿 、赵文军 、田茜 、易建平 、刘玮琦 、胡诗瑶 。

　　I

　　GB/T 43169—2023

　　马铃薯斑纹病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本文件描述了马铃薯斑纹病菌的检疫鉴定方法 。

　　本文件适用于茄科和伞形科等植物的种子 、种苗 、块茎 、块根等植物材料以及传播介体木虱中马铃薯斑纹病菌的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文本必不可少的条款 。 其中 , 注 日期的引用文件 , 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件 , 其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义 。

　　4 马铃薯斑纹病菌基本信息

　　中文名称:马铃薯斑纹病菌

　　拉丁学名 : candidatus Liberibacter solanacearum Liefting et al. , 2009

　　英文名称: zebra chip disease , zebra complex

　　中文异名:斑马片病 、马铃薯斑纹片病菌

　　同物异名 : candidatus Liberibacter psyllaurous Hansen et al. , 2008

　　分类地位:原 核 生 物 界(kingdom Monera) , 变 形 菌 门 (Proteobacteria) , α -变 形 菌 纲 (Alphapro- teobacteria) , 根 瘤 菌 目 (Rhizobiales) , 叶 杆 菌 科 (Phyllobacteriaceae) , 韧 皮 部 杆 菌 属 (candidatus Liberibacter) 。

　　马铃薯斑纹病菌其他信息见附录 A。

　　5 方法原理

　　马铃薯斑纹病菌目前还无法培养 , 因此方法原理为采用马铃薯斑纹病菌特异性引物或探针 , 通过普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction , PCR) 、巢式 PCR或实时荧光 PCR方法进行检测 。

　　6 仪器设备和主要试剂

　　6 . 1 仪器设备

　　6 . 1 . 1 实时荧光 PCR仪

　　支持寡核苷酸探针(TaqMan)双标记水解探针 , 温度控制范围为 30 ℃ ~100 ℃ 。

　　1

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　　6 . 1 . 2 PCR仪

　　温度控制范围为 4 ℃ ~99 ℃ 。

　　6 . 1 . 3 核酸分析仪

　　波长为 230 nm~260 nm 。

　　6 . 1 . 4 超净工作台

　　洁净等级 100 级 , 过滤效率达到 99 . 99% 。

　　6 . 1 . 5 电泳仪

　　电压 10 v~300 v , 最小可调 1 v;电流 4 mA~400 mA, 最小可调 1 mA。

　　6 . 1 . 6 凝胶成像分析仪

　　紫外透射波长为 302 nm 。

　　6 . 1 . 7 研磨机

　　转速为 50 r/min~600 r/min 。

　　6 . 1 . 8 台式小型离心机

　　转速 ≥12 000 r/min 。

　　6 . 1 . 9 旋涡振荡器

　　转速为 200 r/min~3 000 r/min 。

　　6 . 1 . 10 微量进样器

　　量程为 0. 2 μL~2 . 5 μL、1 . 0 μL~10 μL、10 μL~100 μL、100 μL~1 000 μL。

　　6 . 1 . 1 1 电子天平

　　精确度为 0. 001 g 。

　　6 . 1 . 12 水浴锅

　　温度控制范围为室温至 100 ℃ 。

　　6 . 1 . 13 纯水仪

　　制备出的纯水水质应符合 GB/T 6682 中一级水的规格 。

　　6 . 1 . 14 高压灭菌器

　　最高工作温度不低于 121 ℃ 。

　　6 . 2 主要试剂

　　除另有规定外 , 所有试剂均为分析纯 。磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline , PBS) 、液氮 、聚乙二醇辛基苯基醚(Tritonx-100) 、PCR缓冲液 、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs) 、脱氧核糖核酸(de-

　　2

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　　oxyribo nucleic acid , DNA)聚合酶 、引物和探针 、琼脂糖 、三氯甲烷 、异丙醇 、无水乙醇 、双重去离子水(double distilled water , ddH2 O) 。

　　7 病菌的鉴定

　　7 . 1 症状检查

　　该病菌在不同寄主甚至同一寄主不同品种上的为害症状及为害程度均有差异 。 马铃薯 、番茄可检查植株地上部分 , 主要表现为叶片黄化矮化 、叶脉变色 、全株叶片向上卷曲 、叶片焦枯 、腋芽增生 、节间缩短肿大 、气生块茎 、果实畸形发育停滞;此外 , 马铃薯还可检查植株地下部分 , 症状表现为匍匐茎倒伏 、维管束组织变褐 、内部组织产生髓质射线 , 该症状通常在块茎切片或切块油炸后表现较为明显 , 即薯片或薯条出现黑斑或斑纹 。胡萝 卜 、芹菜可检查植株地上和地下部分 , 地上部分的症状表现为叶片卷曲黄化 、叶片增生;地下部分症状表现为根变形 、发育不良以及次生根增殖 。具体症状图片见附录 B。

　　7 . 2 样品采集与制备

　　7 . 2 . 1 植株样品制备

　　采集样品时要同时采集有症状和无症状的叶片和/或茎 , 从有症状的植物上取 3 片 ~5 片植物叶片和/或茎 , 无症状植物上不同部位取 5 片 ~10 片叶子(包括新生叶片)和/或茎 。植物地下部分如马铃薯块茎 , 胡萝 卜根等都能够用来检测马铃薯斑纹病菌 , 选取症状明显的组织进行检测 。 在进行提取之前 , 要对材料进行二次取样 , 以保证材料包含较多的维管束组织 , 例如:叶柄 、叶中脉 、形成层或马铃薯块茎维管束环 。植物样品用研磨仪或液氮进行研磨处理 。

　　7 . 2 . 2 种子样品制备

　　种子样品可任选以下两种方法之一进行制备处理:

　　— 取种子样品 1 g ~2 g(例如:胡萝 卜种子约 450 粒 ~900 粒)直接用研钵研磨 , 或用研磨机研磨 , 或置塑料袋内用锤子粉碎后 , 取适量粉碎样品提取核酸 ;

　　— 取种子样品 1 g ~2 g(例如:胡萝 卜种子约 450 粒 ~900 粒)加入 50 mL~100 mL PBS缓冲液4 ℃冰箱浸泡过夜 , 弃缓冲液 , 浸泡后的种子用研磨仪研磨 , 研磨后加 20 mL PBS缓冲液振荡混匀 , 然后用纱布或滤纸过滤 , 滤液 12 000 r/min离心后取沉淀物提取核酸 。

　　另外 , 如果是种衣剂处理过的种子应先去除种衣 , 按照每克种子加入 10 mL~50 mL0. 5%Triton X-100 的比例振荡洗涤 30 min , 洗 3 次后在水中过夜软化 , 再任选上述两种方法之一进行制备处理 。

　　7 . 2 . 3 木虱样品制备

　　从有症状或无症状的植物中收集成虫木虱 , 置于研钵中加入液氮研磨备用 。

　　7 . 3 核酸提取

　　根据常规的十六烷基三甲基溴化铵法(Cetyltrimethylammonium bromide , CTAB)或商业化核酸提取试剂盒规定的质量 , 取植物组织 、木虱样品研磨粉末状物质或种子浸泡液的沉淀物提取待测样品核酸 , 且应根据不同提取物(植物 、昆虫)选择合适的商业化核酸提取试剂盒 。

　　7 . 4 检测

　　选用普通 PCR、巢式 PCR、实时荧光 PCR检测方法中的任意一种 , 检测具体操作步骤按照附录 C、附录 D 和附录 E 的规定 。

　　3

　　GB/T 43169—2023

　　8 结果判定

　　选用普通 PCR、巢式 PCR、实时荧光 PCR检测方法中任意一种的检测结果为阳性 , 可判定检出马铃薯斑纹病菌 。

　　9 样品保存

　　植物组织样品置于密封样品袋保存于 4 ℃冰箱中 , 木虱样品保存于 70%乙醇中 , 以备复核 。 阳性样品保存期满后应经高压灭菌后方再处理 。

　　10 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 : 样品的来源 、种类 、接收时间 、实验的时间 、地点 、方法和结果等 , 并要有经手人和实验人员的签字 。对检出马铃薯斑纹病菌的样品应保存于 4 ℃冰箱中 , 以备复核 。普通 PCR和巢式 PCR琼脂糖凝胶电泳检测电泳结果图片 、荧光 PCR检测原始数据等资料应妥善保存 。

　　4

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　马铃薯斑纹病菌相关信息

　　A. 1 症状特征

　　马铃薯斑纹病菌危害寄主植物的叶片 、枝干 、块茎等部位,在不同寄主上的症状存在一定的差异。

　　马铃薯 、番茄等茄科植物的地上部分的症状与植原体的危害症状类似,表现为叶片黄化矮化 、叶脉变色 、全株叶片向上卷曲 、叶片焦枯 、腋芽增生 、节间缩短肿大 、气生块茎 、果实畸形发育停滞;马铃薯的地下部分症状表现为匍匐茎倒伏 、维管束组织变褐 、内部组织产生髓质射线。 该症状通常在块茎切片或切块油炸后表现较为明显,即薯片或薯条出现黑斑或斑纹。

　　胡萝 卜 、芹菜等伞形科植物的地上部分的症状与植原体的危害症状类似,表现为叶片卷曲黄化 、叶片增生;地下部分症状表现为根变形 、发育不良以及次生根增殖。

　　A. 2 寄主范围

　　马铃薯斑纹病菌已知寄主主要有茄科和伞形科植物,茄科包括:马铃薯(solanum tuberosum),番茄(s. lycopersicum) ,茄子(s. melongena),树番茄(s. betaceum) ,银叶茄(s. elaeagnifolium),东方龙葵 ( s. ptycanthum ) , 辣 椒 (capsicum annuum ) , 烟 草 ( Nicotiana tabacum ) , 灯 笼 果 ( physalis peru℃iana),和枸 杞 (Lycium barbarum) 等 。 伞 形 科 包 括 : 胡 萝 卜 ( Daucus carota) , 芹 菜 (Apium gra℃eolens),茴香(Foeniculum ℃ulgare),芫荽(petroselinum crispum) ,欧防风(pastinaca sati℃a) ,香芹(Libanotis seseloides)和欧洲萝 卜 (pastinaca sati℃a)等。 蓼科 、旋花科和荨麻科也是其寄主。 马铃薯斑纹病菌潜在的寄主范围比已知的寄主范围更广泛。

　　A. 3 分布

　　目前已报道马铃薯斑纹病菌分布的国家或地区如下 :

　　非洲:摩洛哥 、突尼斯 ;

　　北美洲:加拿大 、厄瓜多尔 、萨尔瓦多 、危地马拉 、洪都拉斯 、墨西哥 、尼加拉瓜 、美国 ;

　　亚洲:以色列 ;

　　欧洲:奥地利 、比利时 、爱沙尼亚 、芬兰 、德国 、希腊 、意大利 、挪威 、葡萄牙 、西班牙 、瑞典 、英国 、加那利群岛 ;

　　大洋洲:新西兰 、诺福克岛。

　　A. 4 传播途径

　　马铃薯斑纹病菌可通过带菌薯块和种子等繁殖材料进行远距离传播 ; 田间通过昆虫介体传播。 此外,病菌还可通过嫁接 、染病植株 、带菌种子和马铃薯种薯等进行传播和扩散。

　　目前报道的传播介体包括:马铃薯木虱(Bactericera cockerelli) 、B. trigonica 、B. maculipennis 和胡萝 卜木虱(Trio≈a apicalis)等。

　　A. 5 单倍型

　　马铃薯斑纹病菌目前已知的单倍型有 10 种(见表 A. 1),不同单倍型之间具有不同的地理范围和植物宿主,且与木虱的种类和取食行为密切相关。

　　5

　　GB/T 43169—2023

　　表 A. 1 马铃薯斑纹病菌 10 种单倍型的信息

　　单倍型

　　寄主

　　分布地区

　　传播媒介

　　A

　　马铃薯 、番茄

　　中美洲:洪都拉斯 、危地马拉

　　北美洲:墨西哥 、美国(亚利桑那州 、加利福尼亚州 、俄勒冈州 、华盛顿州 、爱达荷州)

　　大洋洲:新西兰

　　马 铃 薯 木 虱 ( Bactericera cock- erelli)

　　B

　　马铃薯 、番茄

　　北美洲:墨西哥 、美国

　　马 铃 薯 木 虱 ( Bactericera cock- erelli) 、B. maculipennis

　　C

　　胡萝 卜 、芹 菜 、茴 香 、芫荽等

　　欧洲:芬兰 、瑞典 、挪威 、德国 、奥地利

　　胡萝 卜木虱(Trio义a apicalis)

　　D

　　胡萝 卜 、芹 菜 、茴 香 、芫荽等

　　亚洲:以色列

　　欧洲:比利 时 、西 班 牙 、法 国 、希 腊 、葡 萄 牙 、捷克 、意大利 、加那利群岛

　　非洲:突尼斯 、摩洛哥

　　Bactericera trigonica

　　E

　　马铃薯 、番茄 、胡萝卜 、芹 菜 、茴 香 、芫荽等

　　亚洲:以色列 、日本

　　欧洲:比利 时 、西 班 牙 、法 国 、希 腊 、葡 萄 牙 、加那利群岛

　　非洲:突尼斯 、摩洛哥

　　马 铃 薯 木 虱 ( Bactericera cock- erelli) 、B. trigonica

　　F

　　马铃薯

　　北美洲:美国

　　马 铃 薯 木 虱 ( Bactericera cock- erelli)

　　G

　　马铃薯

　　北美洲:美国

　　马 铃 薯 木 虱 ( Bactericera cock- erelli)

　　H

　　伞形花科;蓼科

　　欧洲:芬兰

　　未知

　　H(Con)

　　旋花科

　　北美洲:美国

　　未知

　　U

　　荨麻

　　北美洲:墨西哥

　　欧洲:芬兰 、德国

　　荨麻木虱(Trio义a urticae)

　　6

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　马铃薯斑纹病菌危害症状

　　马铃薯斑纹病菌危害马铃薯 、番茄 、胡萝 卜 、芹菜的症状分别见图 B. 1 、图 B. 2 、图 B. 3 、图 B. 4 。

　　a) 马铃薯斑纹病菌危害马铃薯叶片的症状 b) 马铃薯斑纹病菌危害马铃薯叶片的症状

　　c) 马铃薯斑纹病菌危害马铃薯块茎的症状 d) 马铃薯斑纹病菌危害马铃薯块茎的症状

　　7

　　e) 马铃薯斑纹病菌危害马铃薯块茎切片

　　油炸后的症状

　　

　　f) 马铃薯斑纹病菌危害马铃薯块茎切条

　　油炸后的症状

　　图 B. 1 马铃薯斑纹病菌危害马铃薯的症状

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　　a) 马铃薯斑纹病菌危害番茄的田间症状 b) 马铃薯斑纹病菌危害番茄出现的叶片黄化 、卷曲症状

　　图 B. 2 马铃薯斑纹病菌危害番茄的症状

　　注 : 左为马铃薯斑纹病菌危害胡萝 卜叶片出现卷叶和紫化的症状 ; 中为马铃薯斑纹病菌危害胡萝 卜叶片仅出现卷叶的症状;右为正常的胡萝 卜 。

　　图 B. 3 马铃薯斑纹病菌危害胡萝 卜的症状

　　a) 马铃薯斑纹病菌危害芹菜的切面症状 b) 马铃薯斑纹病菌危害芹菜出现的叶片增生症状

　　图 B. 4 马铃薯斑纹病菌危害芹菜的症状

　　8

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　　附 录 C

　　(规范性)

　　马铃薯斑纹病菌普通 PCR检测程序

　　C. 1 普通 PCR扩增

　　C. 1 . 1 引物序列

　　普通 PCR检测的引物序列见表 C. 1 。

　　表 C. 1 普通 PCR检测的引物序列

　　引物名称

　　引物序列

　　PCR产物大小/bp

　　Lso TX 16/23 F

　　上游引物 : 5 , -aattttagcaagttctaaggg-3 ,

　　383

　　Lso TX 16/23 R

　　下游引物 : 5 , -ggtacctcccatatcgc-3 ,

　　C. 1 . 2 反应体系及反应条件

　　普通 PCR反应体系见表 C. 2 。反应条件为 : 94 ℃ 3 min ; 94 ℃ 30 s , 55 ℃ 30 s , 72 ℃ 40 s , 40 个循环;72 ℃ 5 min(当使用不同仪器和试剂时 , 可根据要求将反应参数进行适当调整) 。 预期扩增产物为383 bp 。

　　上述反应中均需同时设置阳性对照(马铃薯斑纹病菌) 、阴性对照(健康马铃薯叶片)和空白对照(以灭菌蒸馏水代替模板 DNA) 。

　　表 C. 2 反应体系

　　组成

　　加样量μL

　　10×PCR缓冲液

　　2.5

　　50 mmol/L氯化镁

　　2.0

　　10 mmol/L dNTPs

　　2.0

　　10 μmol/L引物 Lso TX 16/23 F

　　1 . 0

　　10 μmol/L引物 Lso TX 16/23 R

　　1 . 0

　　5 U/μLTaq DNA聚合酶

　　0.5

　　10 ng/μL~100 ng/μL模板 DNA

　　1 . 0

　　ddH2 O

　　补至 25

　　注 : 反应体系中各试剂的量使用等效的 PCR预混液时

　　, 具体情况根据采用的试剂进行适当调整 。

　　C. 2 琼脂糖凝胶电泳

　　制备 1 . 5% 的 琼 脂 糖 凝 胶 , 按 比 例 均 匀 电 泳 上 样 缓 冲 液 和 PCR 扩 增 产 物 , 用 DNA 分 子 标 记(Marker)作为分子质量标记 , 进行电泳分析 , 电泳结束后在凝胶成像仪的紫外投射光下观察是否扩增

　　9

　　GB/T 43169—2023

　　出预期的特异性 DNA条带 , 并拍摄记录 。

　　C. 3 质量控制

　　阳性对照应出现 383 bp 的预期扩增片段 , 阴性对照和空白对照应都未出现 383 bp 的预期扩增片段 。上述指标如有一项不符合者 , 应重新进行普通 PCR扩增 。

　　C. 4 结果判定

　　检测样品如出现 383 bp 的预期扩增片段判为阳性 , 如未出现 383 bp 的预期扩增片段判为阴性 。

　　10

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　　附 录 D

　　(规范性)

　　马铃薯斑纹病菌巢式 PCR方法

　　D. 1 巢式 PCR扩增

　　D. 1 . 1 引物序列

　　巢式 PCR检测的引物序列见表 D. 1 。

　　表 D. 1 巢式 PCR检测的引物序列

　　引物名称

　　引物序列

　　产物大小/bp

　　OA2

　　上游引物 : 5 ’-gcgcttatttttaataggagcggca-3 ’

　　1 160

　　OI2c

　　下游引物 : 5 ’-gcctcgcgacttcgcaacccat-3 ’

　　Lib16S01F

　　上游引物 : 5 ’-ttctacgggataacgcacgg-3 ’

　　580

　　Lib16S01R

　　下游引物 : 5 ’-cgtcagtatcaggccagtgag-3 ’

　　D. 1 . 2 反应体系及反应条件

　　用引物 OA2/OI2c进行第一轮 PCR反应 。反应条件为 : 94 ℃ 5 min ; 94 ℃ 30 s , 58 ℃ 30 s , 72 ℃ 1 min , 30 个循环;72 ℃ 10 min(当使用不同仪器和试剂时 , 可根据要求将反应参数进行适当调整) 。 PCR反应体系见表 D. 2 。

　　表 D. 2 第-轮 PCR反应体系

　　组成

　　加样量μL

　　10×PCR缓冲液

　　2.5

　　50 mmol/L氯化镁

　　2.0

　　10 mmol/L dNTPs

　　2.0

　　10 μmol/L引物 OA2

　　1 . 0

　　10 μmol/L引物 OI2c

　　1 . 0

　　5 U/μLTaq DNA聚合酶

　　0.5

　　10 ng/μL~100 ng/μL模板 DNA

　　1 . 0

　　ddH2 O

　　补至 25

　　注 : 反应体系中各试剂的量使用等效的 PCR预混液时

　　, 具体情况根据采用的试剂进行适当调整 。

　　取第一轮 PCR产物稀释 10 倍后取 1 μL为模板利用引物 Lib16S01F/Lib16S01R进行第二轮 PCR反应 。反应条件为 : 94 ℃ 5 min ; 94 ℃ 30 s , 58 ℃ 30 s , 72 ℃ 1 min , 35 个循环 ; 72 ℃ 10 min (当使用不同仪器和试剂时 , 可根据要求将反应参数做适当调整) 。PCR反应体系见表 D. 3 。

　　11

　　GB/T 43169—2023

　　表 D. 3 第二轮 PCR反应体系

　　组成

　　加样量μL

　　10×PCR缓冲液

　　2.5

　　50 mmol/L氯化镁

　　2.0

　　10 mmol/LdNTPs

　　2.0

　　10 μmol/L引物 Lib16s01F

　　1.0

　　10 μmol/L引物 Lib16s01R

　　1.0

　　5 U/μLTaq DNA聚合酶

　　0.5

　　第一轮 PCR反应产物

　　1.0

　　ddH2 O

　　补至 25

　　注 : 反应体系中各试剂的量使用等效的 PCR预混液时

　　, 具体情况根据采用的试剂进行适当调整 。

　　上述反应中均需同时设置阳性对照(马铃薯斑纹病菌) 、阴性对照(健康马铃薯叶片)和空白对照(以蒸馏水代替模板 DNA) 。

　　D. 2 琼脂糖凝胶电泳

　　制备 1 . 5%的琼脂糖凝胶 , 按比例均匀电泳上样缓冲液和 PCR扩增产物 , 用 DNA Marker 作为分子质量标记 , 进行电泳分析 , 电泳结束后在凝胶成像仪的紫外投射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA条带 , 并拍摄记录 。

　　D. 3 质量控制

　　阳性对照应出现 580 bp 的预期扩增片段 , 阴性对照和空白对照应都未出现 580 bp 的预期扩增片段 。上述指标如有一项不符合者 , 应重新进行巢式 PCR扩增 。

　　D. 4 结果判定

　　检测样品如出现 580 bp 的预期扩增片段判为阳性 , 如未出现 580 bp 的预期扩增片段判为阴性 。

　　12

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　　附 录 E

　　(规范性)

　　马铃薯斑纹病菌实时荧光 PCR方法

　　E. 1 实时荧光 PCR检测

　　E. 1 . 1 引物及探针序列

　　实时荧光 PCR检测的引物及探针序列见表 E. 1 。

　　表 E. 1 实时荧光 PCR检测的引物及探针序列

　　引物及探针名称

　　引物及探针序列

　　LsoF

　　上游引物 : 5 I -gtcgagcgcttatttttaatagga-3 I

　　HLBr

　　下游引物 : 5 I -gcgttatcccgtagaaaaaggtag-3 I

　　HLBP

　　探针:5 I -FAM-agacgggtgagtaacgcg-BHQ-3 I

　　E. 1 . 2 反应体系及反应条件

　　实时荧光 PCR反应程序: 95 ℃ 10 min ; 95 ℃ 15 s , 60 ℃ 60 s , 40 个循环 , 每个循环结束后采集FAM 通道荧光信号(当使用不同仪器和试剂时 , 可根据要求将反应参数进行适当调整) 。 反应体系见表 E. 2 。

　　上述反应中均需同时设置阳性对照(马铃薯斑纹病菌) 、阴性对照(健康马铃薯叶片)和空白对照(以灭菌蒸馏水代替模板 DNA) 。

　　表 E. 2 反应体系

　　组成

　　加样量μL

　　2×TaqMan real-time PCR master mix

　　12 . 5

　　10 μmol/L引物 LsoF

　　1 . 0

　　10 μmol/L引物 HLBr

　　1 . 0

　　10 μmol/L探针 HLBP

　　0.5

　　10 ng/μL~100 ng/μL模板 DNA

　　1 . 0