GB/T 45101-2024 动物炭疽诊断技术

　　ICS 11.220 CCS B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 45101—2024

　　动物炭疽诊断技术

　　Diagnostictechniquesforanimalanthrax

　　2024-12-31发布 2025-07-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 45101—2024

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　引言 Ⅳ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 缩略语 1

　　5 生物安全措施 1

　　6 临床诊断 2

　　6. 1 流行特点 2

　　6. 2 临床症状 2

　　6. 3 病理变化 2

　　6. 4 结果判定 3

　　7 样品的采集 、保存 、运输和处理 3

　　7. 1 样品的采集 3

　　7. 2 样品的保存与运输 3

　　7. 3 样品的处理 3

　　8 实验室诊断 4

　　8. 1 染色镜检 4

　　8. 2 分离与鉴定 5

　　8. 3 γ 噬菌体裂解试验和青霉素抑制试验 6

　　8. 4 PCR 6

　　8. 5 Real-time PCR 8

　　8. 6 环状沉淀试验(Ascoli试验) 9

　　9 综合判定 10

　　附录 A (规范性) 试剂的配制 11

　　A. 1 草酸铵结晶紫染色液 11

　　A. 2 革兰氏碘液 11

　　A. 3 沙黄复染液 11

　　A. 4 碱性美蓝染色液 11

　　A. 5 5% ~ 7%马或羊血琼脂平板 11

　　A. 6 PLET琼脂平板 11

　　A. 7 普通营养肉汤 11

　　A. 8 普通营养琼脂平板 11

　　Ⅰ

　　GB/T 45101—2024

　　A. 9 0. 7%碳酸氢钠琼脂平板 11

　　A. 10 50×TAE 电泳缓冲液 12

　　A. 11 2%琼脂糖凝胶 12

　　A. 12 0. 5%苯酚生理盐水 12

　　附录 B (资料性) 核酸检测用引物 、探针序列信息及扩增结果图 13

　　B. 1 炭疽杆菌 PCR 引物 13

　　B. 2 炭疽杆菌 PCR扩增产物电泳图 13

　　B. 3 Real-time PCR 引物和探针 13

　　B. 4 炭疽杆菌 PA基因实时荧光 PCR扩增曲线图 14

　　B. 5 炭疽杆菌 CA基因实时荧光 PCR扩增曲线图 14

　　附录 C (资料性) 炭疽杆菌 PCR 阳性对照重组质粒的目的基因序列 15

　　C. 1 炭疽杆菌保护性抗原基因(PA)重组质粒参考序列 15

　　C. 2 炭疽杆菌荚膜基因(CA)重组质粒参考序列 15

　　附录 D (资料性) 环状沉淀试验结果图 16

　　参考文献 17

　　Ⅱ

　　GB/T 45101—2024

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由中华人民共和国农业农村部提出 。

　　本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 、军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 、中国兽医药品监察所 、北京市动物疫病预防控制中心 。

　　本文件主 要 起 草 人 : 丁 家 波 、秦 彤 、祝 令 伟 、蒋 卉 、郭 学 军 、张 莹 辉 、范 学 政 、彭 小 薇 、冯 宇 、王 林 、程汝佳 。

　　Ⅲ

　　GB/T 45101—2024

　　引 言

　　炭疽(Anthrax)是由炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)引起的一种人兽共患急性 、热性 、败血性传染病 ,广泛分布于世界各地 。该病主要发生于畜间 , 以牛 、羊 、马等草食动物最为易感 ,杂食动物次之 ,人主要通过接触患炭疽的动物或污染的动物制品 、环境感染而患病 。动物感染炭疽主要分为最急性型 、急性型 、亚急性型和慢性 型 的 临 床 类 型 , 各 类 型 病 死 率 均 较 高 , 危 害 严 重 人 畜 健 康 。世 界 动 物 卫 生 组 织(WOAH)将其列为必须报告的动物疫病 ,我国将其列为二类动物疫病 。

　　本文件 的 制 定 参 考 了 WOAH《陆 生 动 物 诊 断 试 验 和 疫 苗 手 册》(2023年 版) 3. 1. 1 章 炭 疽 诊 断 技术 ,并结合了我国相关技术研究新成果 。

　　Ⅳ

　　GB/T 45101—2024

　　动物炭疽诊断技术

　　1 范围

　　本文件描述了动物炭疽的临床诊断 、染色镜检 、分离与鉴定 、γ 噬菌体裂解试验 、青霉素抑制试验 、 PCR、Real-time PCR、环状沉淀试验等实验室诊断方法 。

　　本文件适用于动物炭疽的诊断 、检测 、检疫 、监测和流行病学调查 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 ,其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义 。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　Ct值 :循环阈值(Cycle Threshold)

　　DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate)

　　DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)

　　EDTA: 乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)

　　FAM :6-羧基荧光素(6-Carboxy-Fluorescein)

　　NFQ-MGB:非荧光淬灭剂-小沟结合物(Non-FluorescentQuencher-Minor Groove Binder)

　　PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

　　PLET:多黏菌素 B-溶菌酶-乙二胺四乙酸-乙酸亚铊(Polymyxin B-Lysozyme-EDTA-Thallous ace- tate Agar)

　　Real-time PCR:实时荧光 PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction)

　　TAE:三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸醋酸缓冲液(Tris-Acetate-EDTA Buffer)

　　5 生物安全措施

　　严禁在非生物安全条件下进行疑似炭疽患病动物 、患病动物的尸体剖检 。采样及样品处理过程中应采取必要的防护措施 , 防止感染人员及污染环境 。从事炭疽诊断活动的实验室应按照 GB 19489 的规定进行风险评估和风险控制 。

　　1

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　　6 临床诊断

　　6. 1 流行特点

　　6. 1. 1 易感动物

　　所有哺乳动物 ,包括人类和一些鸟类都可感染炭疽 ,其中草食动物最易感 。

　　6. 1.2 传染源

　　患病动物和因炭疽而死亡的动物尸体以及受其污染的土壤 、草地 、水和饲料是主要传染源 ,炭疽芽孢对环境具有很强的抵抗力 ,其污染的土壤和场地可形成持久的疫源地 。

　　6. 1.3 传播途径

　　主要经皮肤 、消化道和呼吸道传播 。动物破损的皮肤黏膜直接接触病原菌 ,采食被污染的饲料 、饲草及饮水等 , 以及吸入带炭疽芽孢的尘埃 、飞沫等都可导致炭疽感染 ,也可通过昆虫叮咬传播 。

　　6. 1.4 流行特征

　　呈地方性散发流行 。有一定的季节性 ,多发生在吸血昆虫多 、雨水多和洪水泛滥的季节 。

　　6.2 临床症状

　　6.2. 1 最急性型

　　多见于反刍动物 , 无 明 显 临 床 症 状 即 突 然 死 亡 。 动 物 死 前 数 小 时 仍 健 康 , 濒 死 时 常 见 体 温 高 达42 ℃ ,肌肉震颤 , 呼吸困难 ,黏膜充血 , 随即动物间歇性抽搐 、虚脱 、死亡 。死后血液凝固不良 ,肛门 、阴门 、鼻腔 、口腔等天然孔流出血液 ,并常见尸僵不全 。

　　6.2.2 急性型

　　多见于牛 , 临床表现为兴奋后又高度沉郁 ,前期体温升高后期体温下降 , 呼吸急促 ,心跳加快 ,反刍停止 ,黏膜充血 、水肿 ,一般经 1 d~ 2 d后死亡 。也常见于马 , 随感染部位不同而表现不同 ,摄入芽孢后引起明显腹痛 ,伴有高热和精神沉郁 ,一般经 2 d~4 d后死亡 ;皮下感染芽孢(如通过昆虫叮咬)可引起该部位发热 、疼痛 、水肿 ,后出现在咽喉 、胸廓 、腹部 、包皮 、乳房等部位 ,喉部肿胀会引起呼吸困难并压迫气管 ,病程长短不一 ,最终死亡 。

　　6.2.3 亚急性型和慢性型

　　多见于家养或野生的猪 、犬和猫 , 动物常因采食被炭疽杆菌污染的饲料而发生感染 。 可见颈 、胸 、腰 、直肠或外阴部发生水肿 ,局部温度增高 ,有时龟裂 ,渗出淡红黄色液体 。 颈部水肿可波及咽喉 ,加重呼吸困难 。有些动物发病几天后可以康复 。部分动物表现为严重的胃肠炎和咽炎等症状 ,也可见在唇 、舌及硬腭等黏膜的痈性肿胀 。

　　6.3 病理变化

　　6.3. 1 反刍动物常见血液不凝 ,呈暗色 ,脾肿大 ,呈黑草莓样 ,有大量特征性败血症的出血点 。

　　6.3.2 马病理变化基本与反刍动物相同 ,有些马的喉部与颈部常可能出现水肿 ,而内部器官无此变化 。

　　6.3.3 猪和肉食动物可常见如同反刍动物的败血性变化 ,但大多数只在喉部出现严重水肿和炎症 , 胃 、肠 、肠系膜淋巴结有严重的炎症反应 ,有时可见出血和坏死 ,并伴有腹膜炎和胸腔积液 。

　　2

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　　6.4 结果判定

　　出现 6. 2 部分或全部临床症状 ,或出现 6. 3 病理变化的发病动物 ,可判为疑似病例 ,确诊需进一步采样进行实验室诊断 。

　　7 样品的采集、保存、运输和处理

　　7. 1 样品的采集

　　7. 1. 1 新鲜样品采集 :无菌采集患病或刚死亡动物耳部血液 1 mL~ 3 mL,或者抽取病变部水肿液 、渗出液以及天然孔流出的血性物 ,放置于无菌采样管中 。

　　7. 1.2 陈旧样品采集 :从陈旧病料采集肉 、脏器 、骨粒 、毛绒 、皮张等病料 ,每份采集 5 g~ 10g,放置于无菌采样管中 。

　　7. 1.3 环境样品采集 :在怀疑受炭疽杆菌污染的区域(疑似炭疽疫点等) 周围 50 m 内表层土壤(10 cm内)分散采集土壤样本 5 份 ,每份 20 g~ 50 g。在怀疑受炭疽杆菌污染的水域采集水样时 , 蓄水池和池塘选择怀疑泄污口处周围 100 m 范围 ,河流选择怀疑泄污口处下游 100 m~ 1000 m 范围 ,分散采样 ;水深不足 1 m 时 ,在 1/2水深处采样 ,水深超过 1 m 时 ,在水面下 0. 5 m 处采样 ,每份 500 mL,共 5 份 。

　　7.2 样品的保存与运输

　　7.2. 1 样品应置于 2 ℃ ~ 8 ℃的容器中冷藏保存 ,24h 内送至实验室 ;如果保存超过 12h后运输 ,样品应置于 -20 ℃ 以下冷冻保存 。

　　7.2.2 样品的运输包装材料应符合传染性生物因子包装材料的要求 ,包装容器应严格密封 ,消毒处理 。

　　7.2.3 样品到达实验室后 ,尽快处理 ;如不能立即进行处理和检测 ,应置于 -20 ℃以下保存 ;若需长期保存 ,应置于 -70 ℃ 以下保存 。

　　7.3 样品的处理

　　7.3. 1 新鲜样品的处理

　　新鲜血液 、组织液等直接涂于载玻片上 , 自然干燥后火焰固定 ,放置于载玻片盒中 。 直接用于 8. 4和 8. 5 检测的液体样品不作处理 。

　　7.3.2 陈旧样品和环境样品的处理

　　将样品加入两倍体积的灭菌蒸馏水或去离子水中 ,混匀后于(62. 5±0. 5) ℃水浴灭活 15 min,稀释至 10-2或 10-3后接种于固体培养基培养 。用于 8. 4 和 8. 5 检测的样品水浴灭活后使用 。

　　7.3.3 皮张样品的处理(Ascoli试验)

　　陈旧皮张经 121 ℃灭菌 30 min,灭菌时尽量避免进入水分 ,灭菌结束后烘干 。如为鲜皮 ,灭菌前先37 ℃放置 72 h~ 96h后灭菌烘干 。灭菌干燥的皮张剪碎 ,加入 10倍体积的 0. 5%苯酚生理盐水 ,置于8 ℃ ~ 14 ℃浸泡 72 h~ 96h或置于 36 ℃ ~ 37 ℃浸泡 3 h,过滤使浸液完全透明 ,过滤浸液经 121 ℃灭菌 30 min后 ,分装于中性玻璃瓶备用 。

　　3

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　　8 实验室诊断

　　8. 1 染色镜检

　　8. 1. 1 仪器设备

　　8. 1. 1. 1 Ⅱ级生物安全柜 。

　　8. 1. 1.2 光学显微镜 。

　　8. 1. 1.3 高压灭菌锅 。

　　8. 1.2 试剂与材料

　　8. 1.2. 1 载玻片 。

　　8. 1.2.2 一次性接种环 。

　　8. 1.2.3 草酸铵结晶紫染色液 ,按照附录 A 中 A. 1 配制 。

　　8. 1.2.4 革兰氏碘液 ,按照 A. 2 配制 。

　　8. 1.2.5 沙黄复染液 ,按照 A. 3 配制 。

　　8. 1.2.6 碱性美蓝染色液 ,按照 A. 4 配制 。

　　8. 1.3 涂片

　　新鲜血液 、组织液等按 7. 3. 1样品处理方法制备涂片 。 用一次性接种环挑取固体培养单菌落或取少许液体培养物直接涂于载玻片上 ,干燥后加热固定 。

　　8. 1.4 革兰氏染色

　　滴加约 20 μL草酸铵结晶紫染色液于加热固定后的涂片抹面上 ,染色 1 min,水洗 ;滴加革兰氏碘液 ,作用 1 min,水洗 ;滴加 95%(体 积 分 数) 乙 醇 , 脱 色 约 30 s,水 洗 ; 滴 加 沙 黄 复 染 液 , 复 染 1 min, 水洗 ,干燥 ,镜检 。

　　注 : 使用后的载玻片 、冲洗后的废水以及吸水纸需收集后高压灭菌处理或浸泡于次氯酸消毒剂中消毒 。

　　8. 1.5 碱性美蓝荚膜染色

　　将加热固定后的涂片浸入 95% ~ 100%(体积分数)乙醇中约 5 min并干燥 ,滴加约 20μL碱性美蓝染色液于涂片抹面上 ,并使之扩展覆盖成圈 ,染色 5 min后用水冲洗 ,干燥后镜检 。

　　注 : 使用后的载玻片 、冲洗后的废水以及吸水纸需收集后高压灭菌处理或浸泡于次氯酸消毒剂中消毒 。

　　8. 1.6 结果判定

　　8. 1.6. 1 革兰氏染色呈蓝紫色 ,粗大杆菌 ,长 3 μm~ 5 μm ,宽 0. 8 μm~ 1. 2 μm。革兰氏染色不能染出荚膜 ,有时可见椭圆形 、小于菌体未着色的中央芽孢 。病料样本染色 ,菌体单在 、成对或呈短链条排列 ;培养物染色 ,菌体呈竹节状排列 ,两菌接触端平直 。

　　8. 1.6.2 碱性美蓝荚膜染色可见菌体粗大 ,呈深蓝色 ,菌体外围荚膜呈粉红色 。病料样本染色 ,菌体单在 、成对或呈短链条排列 ;培养物染色 ,菌体呈长链条排列 。

　　8. 1.6.3 染色镜检观察到 8. 1. 6. 1 或 8. 1. 6. 2 的菌体特征 ,可初步判定为炭疽杆菌 。

　　4

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　　8.2 分离与鉴定

　　8.2. 1 仪器设备

　　8.2. 1. 1 恒温培养箱 。

　　8.2. 1.2 Ⅱ级生物安全柜 。

　　8.2. 1.3 光学显微镜 。

　　8.2. 1.4 高压灭菌锅 。

　　8.2.2 试剂与材料

　　8.2.2. 1 多黏菌素 。

　　8.2.2.2 5% ~ 7% 马或羊血琼脂平板 ,按照 A. 5 配制 。

　　8.2.2.3 PLET琼脂平板 ,按照 A. 6 配制 。

　　8.2.2.4 普通营养肉汤 ,按照 A. 7 配制 。

　　8.2.2.5 普通营养琼脂平板 ,按照 A. 8 配制 。

　　8.2.2.6 0. 7% 碳酸氢钠营养琼脂平板 ,按照 A. 9 配制 。

　　8.2.3 分离培养

　　8.2.3. 1 新鲜样品的分离培养

　　取血液 、水肿液 、渗出液以及组织或器官切面沾样的拭子直接接种于含有多黏菌素(100 000 IU/L)的 5% ~ 7% 马或羊血琼脂平板表面 ,置于 37 ℃培养 18h~ 24h。

　　8.2.3.2 陈旧样品和环境样品的分离培养

　　取 7. 3. 2处理的稀释样品 ,每个稀释样品取 10 μL~ 100 μL接种 5% ~ 7% 马或羊血琼脂平板 ,置于 37 ℃培养 18h~ 24h。取 250μL~ 300 μL接种 PLET琼脂平板 ,置于 37 ℃培养 40 h~48h。

　　8.2.3.3 典型菌落的培养

　　取 8. 2. 3. 1 或 8. 2. 3. 2琼脂平板培养的典型菌落接种普通营养肉汤或营养琼脂平板 ,置于 37 ℃培养18h~ 24h。

　　8.2.3.4 荚膜诱导培养

　　取 8. 2. 3. 1 或 8. 2. 3. 2琼脂平板培养的典型菌落或 8. 2. 3. 3普通营养肉汤培养物接种含 0. 7% 碳酸氢钠的营养琼脂平板 ,置 20%(体积分数) CO2 培养箱 37 ℃培养 18h~ 24h。

　　8.2.4 菌落形态鉴定

　　在营养琼脂平板上 ,形成扁平 、灰白色 、毛玻璃样 、边缘不整齐 、直径 3 mm~ 5 mm 的粗糙型大菌落 ;在 5% ~ 7% 马或羊血琼脂平板 ,形成粗糙型大菌落 ,菌落周围不溶血 ,呈卷毛发样 ,用接种环粘取有黏稠感 ;在 PLET琼脂平板上 ,生长受轻度抑制 ,形成较小的毛玻璃样粗糙型菌落 。

　　8.2.5 结果判定

　　8.2.5. 1 未分离到典型特征菌落 ,判定为细菌分离阴性 。

　　8.2.5.2 分离到典型特征菌落 ,经 8. 1 染色观察到炭疽杆菌特征 ,且 8. 3、8. 4、8. 5 所述方法至少一种为阳性 ,判定为细菌分离阳性 。

　　5

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　　8.3 γ 噬菌体裂解试验和青霉素抑制试验

　　8.3. 1 仪器设备

　　8.3. 1. 1 恒温培养箱 。

　　8.3. 1.2 Ⅱ级生物安全柜 。

　　8.3. 1.3 高压灭菌锅 。

　　8.3.2 试剂与材料

　　8.3.2. 1 普通营养琼脂平板 ,按照 A. 8 配制 。

　　8.3.2.2 青霉素药敏纸片 。

　　8.3.2.3 标准噬菌体悬液 。

　　8.3.2.4 阳性对照 : Ⅱ号炭疽疫苗菌株(CVCC40202)培养液 。

　　8.3.3 试验程序

　　吸取 100 μL来自 8. 2. 3. 3 肉 汤 培 养 物 为 待 检 菌 液 均 匀 涂 布 于 普 通 营 养 琼 脂 平 板 表 面 , 自 然 干 燥15 min。滴加 10 μL~ 15μL标准噬菌体悬液于平板划定区域的一侧 ;在平板的另一侧贴 1 片含 10 U青霉素的药敏纸片 。 同时 , 以 Ⅱ号炭疽疫苗菌株(CVCC40202) 培养的菌液作为阳性对照 。 37 ℃培养3 h~ 5 h。

　　8.3.4 结果判定

　　8.3.4. 1 噬菌体悬液滴加处细菌不生长 , 出现明显而清亮的噬菌斑(带) , 为噬菌体裂解阳性反应 ;青霉素纸片周围细菌不生长 , 出现明显的抑菌环 ,为青霉素敏感菌株 ,判为阳性反应 。

　　8.3.4. 2 培 养 平 板 上 不 出 现 或 只 出 现 不 明 显 的 噬 菌 斑(带) 和 抑 菌 环 , 应 将 培 养 时 间 延 长 至 12 h~ 18h,再观察结果仍如从前 ,判为阴性反应 。

　　8.4 PCR

　　8.4. 1 仪器设备

　　8.4. 1. 1 PCR扩增仪 。

　　8.4. 1.2 高速冷冻离心机 。

　　8.4. 1.3 混匀器 。

　　8.4. 1.4 微量移液器(2μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL等不同规格)及配套滤芯吸咀 。

　　8.4. 1.5 电泳仪和水平电泳槽 。

　　8.4. 1.6 凝胶成像仪 。

　　8.4. 1.7 Ⅱ级生物安全柜 。

　　8.4.2 试剂与材料

　　8.4.2. 1 PCR扩增管 。

　　8.4.2.2 DNA提取试剂盒 。

　　8.4.2.3 DEPC处理水 。

　　8.4.2.4 Goldview 或其他等效核酸染料 。

　　8.4.2.5 DNA marker(100bp~ 2 000 bp) 。

　　6

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　　8.4.2.6 2×PCR Mix(含染料) 。

　　8.4.2.7 引物 ,序列信息见附录 B 中 B. 1。

　　8.4.2. 8 50×TAE 电泳缓冲液 ,按照 A. 10配制 。

　　8.4.2.9 2% 琼脂糖凝胶 ,按照 A. 11配制 。

　　8.4.2. 10 阳性对照 :用含有目的基因的重组质粒作为阳性对照(目的基因序列信息见附录 C) 。

　　8.4.2. 11 阴性对照 :用无菌水作为阴性对照 。

　　8.4.3 试验程序

　　8.4.3. 1 DNA提取

　　8.4.3. 1. 1 试剂盒提取法 :按 DNA提取试剂盒说明提取 8. 2. 3 分离培养的炭疽杆菌悬液或样品处理液中的 DNA。

　　8.4.3. 1.2 煮沸法 :挑取 8. 2. 3 中新鲜培养的炭疽杆菌菌落或少许培养物 ,溶解于 25 μL无菌去离子水或蒸馏水中 ,于 95 ℃作用 20 min,然后于冰浴中冷却至 4°C左右 ,12000 r/min离心 10 min,取上清液作为模板 。

　　8.4.3.2 反应体系配制

　　配制 50 μLPCR扩增反应体系所需试剂如下 :

　　— 25 μL的 2×PCR Mix (含染料) ;

　　— 1. 0 μL的引物 PA5,50 μmol/L(或引物 1234,10 μmol/L) ;

　　— 1. 0 μL的引物 PA8,50 μmol/L(或引物 1301,10 μmol/L) ;

　　— 5. 0 μL的 DNA模板 ;

　　— 18. 0 μL的 DEPC处理水 。

　　瞬时离心后 ,置 PCR扩增仪内进行扩增 ,每次检测应设置阳性对照和阴性对照 。

　　8.4.3.3 反应程序设置

　　95 ℃预变性 5 min;95℃变性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 30 s,30个循环;72℃延伸 5 min,冷却至 4 ℃ 。

　　8.4.3.4 PCR扩增产物电泳

　　取 10 μLPCR产物点样于 2%琼脂糖凝胶孔中 , 5 V/cm 电压 , 电泳 30 min。 电泳结束后 ,将琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪中观察结果 。

　　8.4.3.5 试验成立的条件

　　阳性对照样品应出现 597bp和 847bp大小的特异性扩增条带 , 阴性对照应无任何扩增条带(PCR扩增产物电泳图见 B. 2) ,试验成立 。

　　8.4.3.6 结果判定

　　被检样品出现 597bp或 847bp中任 1个特异性扩增条带或 2个特异性扩增条带均出现 ,判定为炭疽杆菌核酸阳性 ;被检样品未扩增出特异性条带 ,判定为炭疽杆菌核酸阴性 。

　　7

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　　8.5 Real-timePCR

　　8.5. 1 仪器设备

　　8.5. 1. 1 实时荧光 PCR仪 。

　　8.5. 1.2 高速台式冷冻离心机 。

　　8.5. 1.3 混匀器 。

　　8.5. 1.4 微量移液器(2μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL等不同规格)及配套滤芯吸咀 。

　　8.5. 1.5 Ⅱ级生物安全柜 。

　　8.5.2 试剂与材料

　　8.5.2. 1 引物与探针 ,序列信息见 B. 3。

　　8.5.2.2 荧光 PCR管(板) 。

　　8.5.2.3 DNA提取试剂盒 。

　　8.5.2.4 DEPC处理水 。

　　8.5.2.5 2×探针法实时荧光 PCR预混液 。

　　8.5.2.6 阳性对照 :用含有目的基因的重组质粒作为阳性对照(目的基因序列信息见附录 C) 。

　　8.5.2.7 阴性对照 :用无菌水作为阴性对照 。

　　8.5.3 试验程序

　　8.5.3. 1 DNA提取同 8. 4. 3. 1。

　　8.5.3.2 反应体系配制

　　配制 20 μL反应体系所需试剂如下 :

　　— 10 μL的 2×探针法实时荧光 PCR预混液 ;

　　—0. 4 μL的引物 PA-F(或引物 CA-F)(10 μmol/L) ;

　　—0. 4 μL的引物 PA-R(或引物 CA-R)(10 μmol/L) ;

　　—0. 2 μL的探针 PA-Probe(或探针 CA-Probe)(10 μmol/L) ;

　　— 1. 0 μL的 DNA模板 ;

　　— 8. 0 μL的 DEPC处理水 。

　　盖紧 PCR管盖或封膜 ,混匀后瞬时离心 ,置实时荧光 PCR 仪内进行扩增 , 每次检测应设置阳性对照和阴性对照 。

　　8.5.3.3 反应程序设置

　　95 ℃预变性 30 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s;40个循环 ,在每个循环 60 ℃时收集 FAM荧光信号 。

　　8.5.3.4 试验成立的条件

　　阴性对照无 Ct值且无特异性扩增曲线 。 阳性对照的 Ct值应<28且出现特异性扩增曲线 ,试验成立 ,否则应重新进行试验 。

　　8

　　GB/T 45101—2024

　　8.5.3.5 结果判定

　　8.5.3.5. 1 PA基因 :被检样品 Ct值 ≤37且出现特异性扩增曲线 ,判定为炭疽杆菌 PA 基因核酸阳性 。被检样品无 Ct值 ,判定为炭疽杆菌 PA基因核酸阴性 。 当 37

　　8.5.3.5.2 CA基因 :被检样品 Ct值 ≤35且出现特异性扩增曲线 ,判定为炭疽杆菌 CA 基因核酸阳性 。被检样品无 Ct值 ,判定为炭疽杆菌 CA 基因核酸阴性 。 当 35

　　8.5.3.5.3 被 检 样 品 炭 疽 杆 菌 PA 基 因 和 CA 基 因 中 任 何 1 个 基 因 核 酸 阳 性 , 或 2 个 基 因 均 核 酸 阳性 ,判定为炭疽杆菌核酸阳性 ;被检样品 PA基因和 CA基因均核酸阴性 ,判定为炭疽杆菌核酸阴性 。

　　8.6 环状沉淀试验(Ascoli试验)

　　8.6. 1 仪器设备

　　8.6. 1. 1 Ⅱ级生物安全柜 。

　　8.6. 1.2 高压灭菌锅 。

　　8.6.2 试剂与材料

　　8.6.2. 1 尖底小试管 。

　　8.6.2.2 炭疽沉淀素血清 。

　　8.6.2.3 阴性血清 。

　　8.6.2.4 炭疽杆菌抗原 。

　　8.6.2.5 0. 5%苯酚生理盐水 ,按照 A. 12配制 。

　　8.6.3 试验程序

　　8.6.3. 1 用毛细管吸取 7. 3. 3制备的待检抗原滤液 0. 1 mL~0. 2 mL,置于尖底小试管中 。

　　8.6.3.2 用另一根毛细管吸取等量炭疽沉淀素血清(如混浊应先离心使其澄清) ,插入管底徐徐放出血清 ,与抗原滤液形成整齐的接触面 ,在 15 min 内观察结果 。

　　8.6.3.3 按上述方法同时设置炭疽沉淀素血清与炭疽杆菌抗原反应管作为阳性对照 ;炭疽沉淀素血清与 0. 5%苯酚生理盐水反应管 、阴性血清与炭疽杆菌抗原反应管作为阴性对照 。

　　8.6.4 结果判定

　　8.6.4. 1 初检

　　抗原与血清接触后 ,经 15 min在两液接触面处出现致密 、清晰明显的白环为阳性反应 ;两液接触面处白环模糊 ,不明显者为疑似反应 ;两液接触面清晰 ,无白环者为阴性反应 ;两液接触面界限不清 ,或其他原因不能判定者为无结果 。环状沉淀试验结果图见附录 D。

　　8.6.4.2 复检

　　初检呈阳性和疑似的样品应复检 ,复检的方法同初检 。复检再呈阳性反应时 ,判为炭疽沉淀试验阳性 。复检再呈疑似反应时 ,按阳性处理 。

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　　GB/T 45101—2024

　　9 综合判定

　　9. 1 经 6. 4判定为疑似炭疽感染病例 ,采集病例样品经 8. 2 细菌分离鉴定阳性 , 可判定为炭疽确诊病例 ;若采集病例样品经 8. 2 细菌分离鉴定阴性 ,但样品经 8. 4、8. 5 任一项检测为炭疽杆菌核酸阳性的可判定为炭疽确诊病例 ;若 8. 4检测为炭疽杆菌核酸阴性的 ,需按照 8. 5进行复检 ,若检出炭疽杆菌核酸阳性 ,可判定为炭疽确诊病例 。

　　9.2 对于陈旧样品和环境样品 ,经 8. 2 细菌分离鉴定阳性 ,可判定为炭疽杆菌阳性 ;若 8. 2 细菌分离鉴定阴性 ,但样品经 8. 4、8. 5 任一项检测为阳性的可判定为炭疽杆菌核酸阳性 ;若 8. 4 检测为炭疽杆菌核酸阴性的 ,需按照 8. 5进行复检 ,若检出阳性 ,可判定为炭疽杆菌核酸阳性 。

　　9.3 对于皮张样品 ,经 8. 6环状沉淀试验检测为阳性 ,可判定为炭疽杆菌阳性 。

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　　GB/T 45101—2024

　　附 录 A (规范性)试剂的配制

　　A. 1 草酸铵结晶紫染色液

　　称取 1 g结晶紫溶解于 20mL 95%(体积分数)乙醇中 ,然后与 80mL 1%草酸胺水溶液混合 ,室温保存 。

　　A.2 革兰氏碘液

　　称取 1 g碘与 2 g 碘化钾进行混合 ,加入蒸馏水少许 ,待完全溶解后 ,再加蒸馏水至 300 mL, 室温保存 。

　　A.3 沙黄复染液

　　称取 0. 25 g沙黄溶解于 10 mL 95%(体积分数)乙醇中 ,加入 90 mL蒸馏水 ,室温保存 。

　　A.4 碱性美蓝染色液

　　称取 0. 3 g美蓝溶于 30 mL 95%(体积分数)乙醇中 ,然后与 100 mL 0. 01% 氢氧化钾溶液充分混合均匀 ,室温保存 。

　　A.5 5% ~7%马或羊血琼脂平板

　　称取 20 g蛋白胨 、5 g 牛 肉 膏 、5 g 氯 化 钠 、20 g 琼 脂 溶 解 于 900 mL 蒸 馏 水 中 , 调 pH 至 7. 2~ 7. 4,加热煮沸溶解 ,用蒸 馏 水 定 容 至 1 000 mL, 121 ℃高 压 灭 菌 15 min, 待 冷 至 45 ℃ ~ 50 ℃ , 加 入50 mL~ 70 mL无菌的脱纤维马血或羊血 ,混匀后倾注平板 ,4 ℃保存备用 。

　　A.6 PLET琼脂平板

　　按厂家说明称取心浸液基础琼脂培养基 ,加蒸馏水至 1000mL,加入 0. 25g~0. 3 gEDTA 和 0. 4 g乙酸亚铊(有毒 ,操作时应注意) ,混匀后 121 ℃高压灭菌 15 min,待冷至 50 ℃左右 ,加入经过过滤除菌的 30 000 U 多黏菌素和 300 000 U溶菌酶 ,充分混匀后倾注平板 ,4 ℃保存备用 。

　　A.7 普通营养肉汤

　　称取 20 g蛋白胨 、5 g 牛肉膏 、5 g氯化钠加入 900 mL蒸馏水中 ,搅拌均匀 ,必要时加热溶解 ,调节pH 至 7. 2~ 7. 4,用蒸馏水定容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌 15 min,4 ℃保存备用 。

　　A. 8 普通营养琼脂平板

　　称取 20 g蛋白胨 、5 g 牛肉膏 、5 g氯化钠加入 900 mL蒸馏水中 ,搅混均匀 ,必要时加热溶解 ,调节pH 至 7. 2~ 7. 4,加入琼脂粉 20 g,用蒸馏水定容至 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌 15 min,待冷至 45 ℃ ~ 50 ℃时 ,倾注平板 ,4 ℃保存备用 。

　　A.9 0. 7%碳酸氢钠琼脂平板

　　称取 20 g蛋白胨 、5 g 牛肉膏 、5 g氯化钠 、20 g琼脂加入 900 mL蒸馏水中 ,搅混均匀 ,加热溶解调

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　　GB/T 45101—2024

　　节 pH 至 7. 2~ 7. 4,121 ℃高压灭菌 15 min,待冷至 45 ℃ ~ 50 ℃时 ,加入经过过滤除菌的 7%碳酸氢钠溶液 100 mL,混匀后倾注平板 ,4 ℃保存备用 。

　　A. 10 50× TAE 电泳缓冲液

　　称取 242 g三羟基甲基氨基甲烷(Tris) ,量取 57. 1 mL冰乙酸 、100mL 0. 5 mol/LEDTA溶液(pH 8. 0) ,混合均匀后 ,加蒸馏水至 1 000 mL,室温保存 。

　　A. 11 2%琼脂糖凝胶

　　将 2 g琼脂糖和 2 mL 50×TAE 电泳缓冲液加入 96mL蒸馏水中 ,加热融化 ,待温度降到 60 ℃左右 ,加入 2. 5 μLGoldview 核酸染料溶液 ,混合均匀制备凝胶块 。

　　A. 12 0. 5%苯酚生理盐水

　　称取 5 g苯酚 ,加入 500mL~ 800mL 的 45 ℃左右的水中 ,另取 8. 5 g氯化钠溶解于少量蒸馏水并加入苯酚溶液中 ,定容至 1 000 mL,室温保存 。

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　　GB/T 45101—2024

　　附 录 B

　　(资料性)

　　核酸检测用引物、探针序列信息及扩增结果图

　　B. 1 炭疽杆菌 PCR 引物

　　表 B. 1列出了炭疽杆菌 PCR 引物信息 。

　　表 B. 1 炭疽杆菌 PCR 引物

　　靶基因

　　定位

　　引物名称

　　引物序列(5'→ 3')

　　片段长度bp

　　使用浓度μmol/L

　　保护性抗原(PA)

　　质粒 pXO1

　　PA5

　　PA8

　　TCCTAACACTAACGAAGTCG GAGGTAGAAGGATATACGGT

　　597

　　1

　　荚膜(CA)

　　质粒 pXO2

　　1234

　　1301

　　CTGAGCCATTAATCGATATG TCCCACTTACGTAATCTGAG

　　847

　　0. 2

　　B.2 炭疽杆菌 PCR扩增产物电泳图

　　炭疽杆菌 PCR扩增产物电泳图见图 B. 1。

　　标引序号说明 :

　　M — 2 000 bp marker;

　　1 —PA基因 ;

　　2,4 — 阴性对照 ;

　　3 —CA基因 。

　　图 B. 1 炭疽杆菌 PCR扩增产物电泳图

　　B.3 Real-timePCR 引物和探针

　　表 B. 2列出了炭疽杆菌 Real-time PCR 引物和探针信息 。

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　　GB/T 45101—2024

　　表 B.2 Real-timePCR 引物和探针

　　基因名称

　　引物名称

　　序列

　　报告基团5'修饰

　　淬灭基团3'修饰

　　PA

　　PA-F

　　GGTGTCTTGCCTCTGGTGAT

　　—

　　—

　　PA-R

　　CCTGAAAAATGGAGCACGGC

　　—

　　—

　　PA-Probe

　　CATTCTTATCAATCCGTCCTG

　　FAM

　　NFQ-MGB

　　CA

　　CA-F

　　TAGCTGCGACATGGGTACAA

　　—

　　—

　　CA-R

　　CACCAACCATCGTCATCGTC

　　—

　　—

　　CA-Probe

　　TACAGAAGCAGTAGCACCAG

　　FAM

　　NFQ-MGB

　　B.4 炭疽杆菌 PA基因实时荧光 PCR扩增曲线图

　　PA基因实时荧光 PCR扩增曲线图见图 B. 2。

　　图 B.2 PA基因实时荧光 PCR扩增曲线图

　　B.5 炭疽杆菌 CA基因实时荧光 PCR扩增曲线图

　　CA基因实时荧光 PCR扩增曲线图见图 B. 3。

　　图 B.3 CA基因实时荧光 PCR扩增曲线图

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　　GB/T 45101—2024

　　附 录 C

　　(资料性)

　　炭疽杆菌 PCR 阳性对照重组质粒的目的基因序列

　　C. 1 炭疽杆菌保护性抗原基因(PA)重组质粒参考序列

　　tcctaacactaacgaagtcgttggtaacacgttgtagattggagccgtcccagtatttacatatctaatattggcatttaatcttgctgtatcagcg gtatttaaacccattgtttcagcccaagttctttcccctgctagagatagtgaatgatcaattgcgaccgtacttgaattcgaattactaaatcctgcagat acactcccaccaatatcaaagaacgacgcatgcacttctgcatttccatgtacttcactagtatgtgtcctacttgtagaagtatttttacttattgttctcgt ttcactatcagtattctgtgtggattgatcctcattttttgagagaataatattctccatatctacatgtacaatcggataagctgccacaagggggtgtctt gcctctggtgatacattcttatcaatccgtcctgtaaccttttcgaaatcactgtacggatcagaagccgtgctccatttttcaggagatgatttatatttgg ttaatcctttcttttcatgaatattagaaatccatggtgaaagaaaagttcttttatttttgacatcaaccgtatatccttctacctc

　　C.2 炭疽杆菌荚膜基因(CA)重组质粒参考序列

　　ctgagccattaatcgatatgattatggaagaacaaattggcaaaaagcaagcaaaagtgatttaagtggagggacaggaatgtttggatcagat ttatatattgcattagtattaggagttacactgagccttatttttacagaaagaacaggtattttacctgcaggtttagttgtacctggttatttagcactcg tttttaatcagcccgtatttatgttggttgttttatttatcagtattttaacatatgtaatcgttacgtatggtgtttcaagattcatgattttatatggccgta gaaaatttgcggcaacgctaattacaggtatttgtttaaaacttttatttgattattgttatcctgttatgccatttgagatttttgaattccgtggtattgga gttattgttccaggattaattgcaaatacaattcaaagacaagggttaccattaacaattggaactacaattttgttaagtggtgcaacatttgcaatcatg aatatttattacttattttaaggtgaggtagaatgagacgaaaattgacatttcaagaaaagttactgatctttattaagaaaaccaagaaaaaaaatcct cgttatgtagcaatcgtattacctcttatcgcagttatattaatagctgcgacatgggtacaacgtacagaagcagtagcaccagtaaaacatcgtgaga acgaaaaattgacgatgacgatggttggtgacattatgatgggacgtcacgtaaaagagattgttaatcgttacggtacagattatgtttttcgtcatgt ttcgccatatttaaaaaactcagattacgtaagtggga

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　　GB/T 45101—2024

　　附 录 D

　　(资料性)

　　环状沉淀试验结果图

　　环状沉淀试验结果图见图 D. 1。

　　标引序号说明 :

　　A— 阳性反应 ;

　　B— 阴性反应 。

　　图 D. 1 环状沉淀试验结果图

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　　GB/T 45101—2024

　　参 考 文 献

　　[1] ManualofDiagnostic Tests and Vaccines for TerrestrialAnimals(WOAH)

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