GB/T 44293-2024 显微物镜数值孔径图像式测量方法

　　ICS 31.260 CCS L 50

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 44293—2024

　　显微物镜数值孔径图像式测量方法

　　Image measurement method for numerical aperture of microscopic objective

　　2024-08-23 发布 2025-03-01 实施

　　发

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　布

　　GB/T 44293—2024

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 测量原理 2

　　5 测量装置 4

　　5.1 装置组成 4

　　5.2 成像照明模块 4

　　5.3 调焦模块 4

　　5.4 测量照明模块 5

　　5.5 测量模块 5

　　5.6 探测模块 5

　　5.7 数据处理模块 5

　　6 测量环境 5

　　7 测量步骤 5

　　8 不确定度分析 6

　　附录 A (规范性) 数值孔径圆直径和全反射圆直径计算方法 8

　　附录 B (资料性) 显微物镜数值孔径测量结果记录表 10

　　附录 C (资料性) NA1.50 显微物镜数值孔径测量不确定度分析 11

　　参考文献 12

　　Ⅰ

　　GB/T 44293—2024

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分 ：标准化文件的结构和起草规则》 的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中国科学院提出。

　　本文件由全国光电测量标准化技术委员会 (SAC/TC 487)和全国光学和光子学标准化技术委员会(SAC/TC 103)联合归口。

　　本文件起草单位： 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所、齐之明光电智能科技(苏州) 有限公司、苏州国科医工科技发展(集团) 有限公司、苏州市计量测试院、 中国计量科学研究院、 中国科学院空天信息创新研究院、 中国计量大学、宁波舜宇仪器有限公司、宁波永新光学股份有限公司、南京智群光电技术有限公司、之江实验室、南京施密特光学仪器有限公司。

　　本文件主要起草人： 巩岩 、唐玉国 、 张艳微 、 郎松 、 黎俊 、徐英莹 、 王璞 、 占春连 、胡森虎、崔志英、袁群、张建锋、雷震。

　　Ⅲ

　　GB/T 44293—2024

　　显微物镜数值孔径图像式测量方法

　　1 范围

　　本文件描述了显微物镜数值孔径图像式测量方法的测量原理、测量装置、测量环境、测量步骤以及不确定度分析。

　　本文件适用于数值孔径标称值大于 1.00 的无限远校正显微物镜的数值孔径测量 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件。

　　GB/T 26600 显微镜 光学显微术用浸液

　　JB/T 8230.4 显微镜用盖玻片

　　JJF 1059.1—2012 测量不确定度评定与表示

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　全反射圆直径 diameter of total reflection circle

　　在盖玻片下表面和空气界面处反射的，入射角小于全反射临界角的光线在图像传感器上形成的圆形图案的直径。

　　3.2

　　数值孔径圆直径 diameter of numerical aperture circle

　　在盖玻片下表面和空气界面处反射的，入射角大于全反射临界角的光线在图像传感器上形成的圆形图案的直径。

　　3.3

　　物镜 objective

　　物体 成初次像 的成像系统的第一部件。

　　注： 由透镜、透镜装配件及相关部件组成，单独或与镜筒透镜组合使用。

　　[ 来源： GB/T 27668—2023 ，3.1.106，有修改 ]

　　3.4

　　无限远校正物镜 infinity-corrected objective

　　物体的初次像距校正在无限远，因而需用对应镜筒透镜的物镜。

　　[ 来源： GB/T 27668—2023 ，3.1.106.3 ，有修改 ] 3.5

　　数值孔径 numerical aperture;NA

　　以 n sinu 表示，其中 n 为物镜与物体之间介质的折射率， u 为物镜孔径角的一半。

　　[ 来源： GB/T 27668—2023 ，3.1.10.4 ，有修改 ]

　　1

　　GB/T 44293—2024

　　3.6

　　盖玻片 cover glass

　　用于覆盖显微标本的矩形或圆形的薄玻璃片。

　　[ 来源： GB/T 27668—2023 ，3.1.34，有修改 ] 3.7

　　景深 depth of field

　　物空间中能成清晰像的物体所限定的轴向空间距离。

　　[ 来源： GB/T 27668—2023 ，3.1.36，有修改 ] 3.8

　　焦距 focal length

　　从光学系统的主平面到相应的焦平面之间的沿轴距离。

　　[ 来源： GB/T 27668—2023 ，3.1.61，有修改 ] 3.9

　　镜筒透镜 tube lens

　　无限远校正物镜基本组件的中间透镜。

　　[ 来源： GB/T 27668—2023 ，3.1.87.10 ，有修改 ]

　　3.10

　　浸液 immersion liquid

　　指定适用于浸没物镜与物体之间空间的液体。

　　[ 来源： GB/T 27668—2023 ，3.1.78，有修改 ]

　　4 测量原理

　　显微物镜数值孔径图像式测量原理示意见图 1，测量光光源发出的光经过准直镜组扩束形成一束平行光，该平行光经分光棱镜反射后进入待测物镜，再经浸液会聚于盖玻片下表面 。基于光学全反射原理，入射角大于全反射临界角的光线将在盖玻片与空气界面发生全反射，入射角小于全反射临界角的光线将发生反射和透射 。在盖玻片下表面反射的光线再次经待测物镜后形成一束圆环状平行光束，最后经分光棱镜到达图像传感器 。 图像传感器接收到的图像为一个中心区域亮度低、边缘区域亮度高的圆环状图像，该图像的内圆直径为全反射圆直径，外圆直径为数值孔径圆直径。

　　在显微物镜设计时，盖玻片和浸液被看作是显微物镜的一部分，盖玻片的厚度、折射率和色散公差应满足 JB/T 8230.4 的要求，浸液的折射率、色散特性应满足 GB/T 26600 的要求 。在数值孔径测量前，应准备与待测显微物镜匹配且符合要求的盖玻片和浸液。

　　2

　　GB/T 44293—2024

　　标引序号说明：

　　1─LED 光源 ; 9 ─镜筒透镜;

　　2─聚光镜 ; 10─图像传感器;

　　3─载物台 ; 11─数值孔径测量图像;

　　4─调焦机构 ; 12─全反射圆直径;

　　5─盖玻片 ; 13─数值孔径圆直径;

　　6─浸液 ; 14─测量光光源;

　　7─待测显微物镜 ; 15─准直镜组。

　　8─分光棱镜;

　　图 1 显微物镜数值孔径图像式测量方法原理示意图

　　光线在浸液和盖玻片中的传播示意见图 2，当待测显微物镜出射的光线在盖玻片与空气界面发生全反射时，该光线在浸液和盖玻片介质中传播满足公式(1)：

　　n1sin(α 1) = n2sin(α2) = 1 …………………………(1)

　　式中：

　　n1 ─浸液的折射率;

　　α 1 ─满足全反射临界条件的光线在浸液中的传播角度，单位为度 (°);

　　n2 ─盖玻片的折射率;

　　α2 ─满足全反射临界条件的光线在盖玻片中的传播角度，单位为度 (°)。

　　从待测显微物镜出射的边缘光线角度由待测数值孔径决定，该光线在浸液和盖玻片介质中传播满足公式(2)：

　　n1sin(μ 1) = n2sin(μ2) = NA ………………………… )

　　式中：

　　μ 1 ─边缘光线在浸液中的传播角度，单位为度 (°);

　　3

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　　μ2 ─边缘光线在盖玻片中的传播角度，单位为度 (°);

　　NA ─待测显微物镜的数值孔径。

　　标引序号说明：

　　1─待测显微物镜 ; 4 ，7─从待测显微物镜出射的边缘光线;

　　2─浸液 ; 5 ，6─从待测显微物镜出射的满足全发射临界条件的光线。

　　3─盖玻片;

　　图 2 光线在浸液和盖玻片中传播的示意图

　　根据图 1 所示，对于无限远校正显微物镜，其全反射圆直径与数值孔径圆直径分别由公式(3) 和公式(4) 计算得到：

　　D 内 = 2n1fo sin(α 1) (3)

　　D外 = 2n1fo sin(μ 1) (4)

　　式中：

　　D内 ─全反射圆直径，单位为毫米(mm);

　　fo ─待测显微物镜的焦距，单位为毫米(mm);

　　D外 ─数值孔径圆直径，单位为毫米(mm)。

　　由公式 (1)~公式(4) 得到待测显微物镜的数值孔径计算公式(5) 为：

　　NA …………………………(5)

　　5 测量装置

　　5.1 装置组成

　　显微物镜数值孔径图像式测量装置由成像照明模块、调焦模块、测量照明模块、测量模块、探测模块及数据处理模块组成，见图 1。

　　5.2 成像照明模块

　　由 LED 光源和聚光镜构成 。与待测显微物镜联用，实现对盖玻片下表面图案的透射成像。 LED 光源功率可调节，聚光镜数值孔径应大于0.6。

　　5.3 调焦模块

　　由调焦机构和载物台构成 。用于精确调节待测显微物镜与盖玻片之间的距离 。调焦机构位移调节分辨力应优于待测显微物镜景深的二分之一。

　　4

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　　5.4 测量照明模块

　　由光源和准直扩束镜组构成 。该模块输出的测量光束应满足发散角小于 0.4 mrad，光束口径大于待测显微物镜的出瞳，光斑光强分布均匀。

　　5.5 测量模块

　　由分光棱镜、浸液、盖玻片构成。分光棱镜的分光比为 1:1。 浸液及盖玻片的选择应对应待测显微物镜的标称值 。盖玻片的一个表面应标记上用于成像观测的图案，图案厚度应小于待测显微物镜景深，且边缘清晰，可参考 JJG 827 中分辨力板。

　　5.6 探测模块

　　由镜筒透镜和面阵图像传感器构成 。镜筒透镜能够移入和移出光路，移入光路时，应保证其光轴与主光路光轴重合，通过与待测显微物镜联用，保证物面与图像传感器靶面为共轭关系，见图 1 虚线光路 。为了保证显微物镜数值孔径测量图像被有效记录，图像传感器的探测尺寸应大于待测显微物镜出瞳尺寸，分辨率大于 400 像素×400 像素，像元尺寸小于7 μm。

　　5.7 数据处理模块

　　由计算机和测试软件构成 。计算机能够对其他模块中的有源器件进行控制，并接收图像传感器的图像。测试软件根据附录 A 对数值孔径测量图像进行处理，得到数值孔径圆直径和全反射圆直径，最后根据公式(5) 计算得到待测显微物镜数值孔径测量值。

　　6 测量环境

　　测量在室内进行，环境条件应满足：

　　a) 温度：23 ℃±5 ℃;

　　b) 相对湿度 ：20%～70%;

　　c) 气压：86 kPa～106 kPa。

　　7 测量步骤

　　显微物镜数值孔径测量步骤如下：

　　a) 打开测量装置电源和测试软件;

　　b) 将待测显微物镜安装于测量装置的物镜接口上，将盖玻片固定在载物台上，将有标记图案的一面朝下放置;

　　c) 在待测显微物镜前端面与盖玻片之间滴入浸液，确保充满通光空间;

　　d) 打开成像照明光源，关闭测量照明光源，将镜筒透镜移入测量光路中，利用调焦机构进行精密对焦，直至图像传感器上观测到盖玻片下表面图案，且达到最清晰状态;

　　e) 关闭成像照明光源，打开测量照明光源，将镜筒透镜移出光路，确保盖玻片与待测显微物镜之间的距离不变;

　　f) 调节图像传感器曝光时间，确保获得光强较强且无过度曝光的显微物镜数值孔径测量图像，并保存;

　　g) 利用测试软件对显微物镜数值孔径测量图像进行处理，得到数值孔径测量值;

　　h) 重复上述步骤d)～步骤g) ，直至完成N(N>5) 次测量;

　　i) 记录待测显微物镜信息和数值孔径测量结果，记录表格参见附录B。

　　5

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　　8 不确定度分析

　　根据 JJF 1059.1—2012 和数值孔径计算公式(5) ，显微物镜数值孔径的测量不确定度 UNA计算见

　　公式(6) ：

　　UNA

　　6

　　JJF

　　

　　式中：

　　NA ─数值孔径测量结果的算术平均值;

　　UD外 ─数值孔径圆直径的合成标准不确定度，单位为图像传感器上对应的像素数; D外 ─数值孔径圆直径的算术平均值，单位为图像传感器上对应的像素数;

　　UD内 ─全反射圆直径的合成标准不确定度，单位为图像传感器上对应的像素数; ─全反射圆直径的算术平均值，单位为图像传感器上对应的像素数。

　　不确定度 A 类评定方法采用 重复性测量 ，A 类标准不确定度 uA 的计算见公式(7) ：

　　uA ………………………… )

　　式中：

　　xi ─第i次测量结果;

　　N ─测量次数;

　　─N次测量结果的算术平均值。

　　由于测量次数有限，需对 A 类标准不确定度进行修正，取置信概率为 95% ，修正因子 tp 应根据1059.1—2012 中的附录 B 确定取值，修正公式(8) 为：

　　UA = tp uA …………………………(8)

　　式中：

　　UA ─A类扩展不确定度;

　　tp ─修正因子。 根据公式(7) 和公式(8) 计算得到数值孔径圆直径和全反射圆直径的 A 类扩展不确定度，分别记

　　为 UAD 外和 UAD 内 。

　　不确定度 B 类评定方法主要分析圆拟合精度 。经过仿真分析与实验验证，数值孔径圆和全反射圆直径的拟合精度为±2 个像素 。考虑到拟合圆直径的分布为矩形(均匀) 分布，根据 JJF 1059.1—2012 中表 3，置信因子 k取值为 √3 。B 类标准不确定度 uB 的计算见公式(9)：

　　uB ………………………… )

　　式中：

　　a ─ 圆直径的拟合精度;

　　k ─置信因子。

　　取置信概率为 95% ，包含因子 g 为 2 ，对 B 类标准不确定度进行扩展，得到 B 类扩展不确定度UB ，见公式(10)：

　　UB = guB …………………………(10)

　　根据公式(9) 和公式(10) 计算得到数值孔径圆直径和全反射圆直径的 B 类扩展不确定度，分别

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　　记为 UBD 外和 UBD 内 。

　　最后，按照公式(11) 分别计算得到数值孔径圆直径和全反射圆直径的合成标准不确定度，分别记为 UD外和 UD内 。

　　U …………………………(11)

　　式中：

　　U ─合成标准不确定度。

　　以 NA1.50 显微物镜为例，其数值孔径的测量不确定度分析步骤和计算结果参见附录 C。

　　7

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　　附 录 A

　　(规范性)

　　数值孔径圆直径和全反射圆直径计算方法

　　对显微物镜数值孔径测量图像进行处理，提取数值孔径圆和全反射圆的边界，并根据边界计算数值孔径圆和全反射圆的直径，计算步骤如下。

　　a) 将数值孔径测量图像(见图A.1) 转化为( x，y，灰度值) 形式，x 、y分别为图像的横向和纵向像素点坐标。

　　图 A.1 显微物镜数值孔径测量图像

　　b) 利用最大类间方差算法计算数值孔径测量图像的二值化阈值，并利用该阈值对数值孔径测量图像进行二值化，二值化结果见图A.2。

　　图 A.2 显微物镜数值孔径测量图像二值化结果

　　c) 二值化后的图像为一个圆环图案，遍历二值化图像的所有像素，提取所有边界像素点坐标。

　　d) 将边界像素点分为外圆像素点集和内圆像素点集，见图A.3，其中外圆像素点集为数值孔径圆的边界，内圆像素点集为全反射圆的边界。

　　8

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　　图 A.3 圆环边界提取结果

　　e) 根据数值孔径测量图像中数值孔径圆的边界像素点坐标和全反射圆的边界像素点坐标，分别进行圆拟合，并计算得到拟合圆直径，具体计算方法如下：

　　圆方程见公式(A.1)：

　　(x-xc)2 + (y -yc)2 = R2 ………………………… A(.1)

　　式中：

　　x , y ─坐标系横坐标和纵坐标，单位为像素;

　　xc , yc ─ 圆心的横坐标和纵坐标，单位为像素;

　　R ─ 圆半径，单位为像素数。

　　定义辅助函数 g(x;y)见公式(A.2)：

　　g(x;y) = (x-xc)2 + (y -yc)2 - Rfit(2) ………………………… A(.2)

　　式中：

　　Rfit ─最佳拟合圆的半径，单位为像素数。

　　定义目标损失函数 f (x;y)见公式(A.3)：

　　f ………………………… A(.3)

　　式中：

　　xj , yj ─待拟合数据点的横坐标和纵坐标，单位为像素;

　　M ─待拟合数据点的个数。

　　使目标损失函数达到最小值，见公式(A.4 )：

　　………………………… A(.4)根据公式(A.2)、 公式(A.3)、 公式(A.4) 得到拟合圆直径 D 的计算公式(A.5)：

　　D = 2 丨 ………………………… A(.5)

　　9

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　显微物镜数值孔径测量结果记录表

　　显微物镜数值孔径测量结果记录表见表 B.1。

　　表 B.1 显微物镜数值孔径测量结果记录表

　　待测显微物镜型号-编号

　　数值孔径标称值

　　制造商名称

　　制造商地址

　　测量环境温度℃

　　测量环境相对湿度

　　%

　　盖玻片型号

　　浸液型号

　　测量地点

　　测量日期

　　年 月 日

　　测量波长

　　nm

　　测量人员

　　测量次数

　　1

　　2

　　3

　　4

　　5

　　6

　　…

　　N

　　算术平均值

　　测量

　　不确定度

　　数值孔径圆直径像素数

　　…

　　—

　　全反射圆直径像素数

　　…

　　—

　　数值孔径

　　…

　　10

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　NA1.50 显微物镜数值孔径测量不确定度分析

　　NA1.50 显微物镜数值孔径测量结果见表 C.1，其测量不确定度分析步骤如下：

　　a) 根据测量结果，计算得到数值孔径圆直径的算术平均值为790.95，全反射圆直径的算术平均值为526.64，数值孔径测量结果的算术平均值为1.502;

　　b) 利用A类评定方法，根据公式(7) 和公式(8) 计算得到数值孔径圆直径与全反射圆直径的A类扩展不确定度分别为： UAD 外 = 1.959 ， UAD 内 = 1.511，其中修正因子 tp 的取值为2.26(测量次数为10，置信概率为95%);

　　c) 利用B类评定方法，根据公式(9) 和公式(10) 计算得到数值孔径圆直径和全反射圆直径的B类扩展不确定度为： UBD 外 = UBD 内 = 2.309，其中置信因子 k取值为 √3 ，包含因子g取值为2;

　　d) 根据公式 (11) 计算数值孔径圆直径和全反射圆直径的合成标准不确定度分别为 ： UD外 = 3.028 ， UD内 = 2.760;

　　e) 将上述计算结果代入公式(6) ，计算得到数值孔径的测量不确定度为 UNA =0.010(k=2)。

　　表 C.1 NA1.50 显微物镜数值孔径测量结果

　　测量次数

　　数值孔径圆直径像素数

　　全反射圆直径像素数

　　数值孔径

　　1

　　791.37

　　527.22

　　1.501

　　2

　　794.33

　　528.79

　　1.502

　　3

　　785.79

　　525.32

　　1.496

　　4

　　792.96

　　528.67

　　1.500

　　5

　　788.45

　　523.16

　　1.507

　　6

　　791.86

　　527.23

　　1.502

　　7

　　788.25

　　523.65

　　1.505

　　8

　　794.13

　　528.71

　　1.502

　　9

　　791.82

　　528.18

　　1.499

　　10

　　790.58

　　525.48

　　1.504

　　算术平均值

　　790.95

　　526.64

　　1.502

　　11

　　GB/T 44293—2024

　　参 考 文 献

　　[1] GB/T 27668—2023 显微镜 光学显微术术语

　　[2] JJG 827 分辨力板

　　12