GB/T 43650-2024 野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程

　　ICS 65. 020. 01 CCS B 60

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 43650—2024

　　野生动物及其制品 DNA物种鉴定

　　技术规程

　　TechnicalproceduresforDNA speciesidentification ofwild animalsand

　　theirproducts

　　2024-03-15发布 2024-07-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 43650—2024

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语 、定义和缩略语 1

　　3. 1 术语和定义 1

　　3. 2 缩略语 2

　　4 样品采集与储存 2

　　4. 1 样品采集 2

　　4. 2 抽样 2

　　4. 3 取样与储存 2

　　4. 4 运输 3

　　5 DNA鉴定程序的构成 4

　　6 DNA鉴定程序 4

　　6. 1 样品前处理 4

　　6. 2 DNA提取 5

　　6. 3 DNA纯化 5

　　6. 4 DNA质量评估 5

　　6. 5 检测方法 6

　　7 结果表述 10

　　8 追溯方法 10

　　9 污染预防与处理 10

　　10 实验室区域设置 10

　　11 仪器和试剂要求 10

　　12 实验室清洁 10

　　13 安全防护 10

　　14 废弃物处理 10

　　附录 A (资料性) 电泳检测程序 11

　　A. 1 常规电泳检测法 11

　　A. 2 芯片电泳检测法 12

　　A. 3 其他电泳检测法 12

　　附录 B (资料性) 通用引物序列信息 13

　　B. 1 Cytb基因通用引物 13

　　B. 2 COI基因通用引物 13

　　Ⅰ

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　　B. 3 12SrRNA 基因通用引物 13

　　B. 4 16SrRNA 基因通用引物 13

　　附录 C (资料性) 通用引物 PCR反应体系与反应程序 15

　　C. 1 反应体系 15

　　C. 2 反应程序 15

　　附录 D (资料性) 特异性 PCR 的引物 、反应程序与反应体系 16

　　C. 1 高鼻羚羊(Saiga tatarica)特异引物 16

　　C. 2 雪豹(Pantherauncia)特异引物 16

　　C. 3 豹(Panthera pardus)特异引物 17

　　C. 4 虎(Panthera tigris)特异引物 17

　　C. 5 黑熊(Ursusthibetanus)特异引物 17

　　附录 E (资料性) qPCR反应体系与反应程序 18

　　E. 1 反应体系 18

　　E. 2 反应程序 18

　　附录 F (资料性) dPCR反应体系与反应程序 19

　　F. 1 反应体系 19

　　F. 2 反应程序 19

　　参考文献 20

　　Ⅱ

　　GB/T 43650—2024

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由国家林业和草原局提出 。

　　本文件由全国野生动物保护管理与经营利用标准化技术委员会(SAC/TC369)归 口 。

　　本文件起草单位 :东北林业大学 、东北林业大学司法鉴定所 、深圳华大生命科学研究院 、中国海关科学技术研究中心 、黑龙江省公安厅 、哈尔滨检验检测认证集团有限公司 、深圳华大法医科技有限公司 、广东华大法医物证司法鉴定所 、黑龙江省野生动物研究所 、华南动物物种环境损害司法鉴定中心 、南宁海关技术中心 、南京警察学院 、合肥海关技术中心 、广西壮族自治区公安厅 、东营市公安局 。

　　本文件主要起草人 : 白素英、马跃、王震、李波、张伟、孙磊、徐艳春、张利峰、王剑、刘微、杨天天、兰天明、李晓平、危金普、郭小森、李宁、金煜、张宇、孙红瑜、马云龙、金香香、刘闯、刘昌景、胡诗佳、李云飞、张新成、唐闳凯 。

　　Ⅲ

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　　野生动物及其制品 DNA物种鉴定

　　技术规程

　　1 范围

　　本文件规定了对野生动物及其制品的来源进行 DNA物种鉴定时样品采集与储存 、DNA 鉴定程序的构成 、DNA鉴定程序 、结果表述 、追溯方法 、污染预防与处理 、实验室区域设置等主要技术要求 。

　　本文件适用于野生动物及其制品来源物种的 DNA检验鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　GB/T 19495. 2 转基因产品检测 实验室技术要求

　　GB/Z 31233 分立个体类产品随机抽样实施指南

　　GB/T 34796 水溶液中核酸的浓度和纯度检测 紫外分光光度法

　　GA/T 383 法庭科学 DNA实验室检验规范

　　LY/T 2501 野生动物及其产品的物种鉴定规范

　　NY/T 541—2016 兽医诊断样品采集 、保存与运输技术规范

　　3 术语、定义和缩略语

　　3. 1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1. 1

　　DNA条形码 DNA barcode

　　选定的标准区域的 、用于物种鉴定的一段相对较短的保守 DNA 片段 。

　　3. 1.2

　　DNA 物种鉴定 DNA speciesidentification

　　利用 DNA检验技术对野生动物及其制品进行分类地位(科 、属 、种)的判定 。

　　3. 1.3

　　序列比对 alignment

　　利用计算机算法和程序 ,确定两个或多个核苷酸序列的相似性以至于同源性 。

　　3. 1.4

　　引物 primers

　　人工合成的两段互补寡核苷酸片段 ,一段与靶区域 5'端 DNA 模板链互补 ; 另 一 段 与 靶 区 域 3'端DNA模板链互补 。

　　1

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　　3. 1.5

　　荧光探针 fluorescentprobe

　　5'端和 3'端分别标记荧光基团和淬灭基团 ,并与 目的 DNA序列碱基互补的一段 DNA 片段 。

　　3.2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　BOLD:生命条形码数据系统(barcode of life data system)

　　Ct值 :循环阈值(cycle threshold,或 Cq值)

　　Cytb:细胞色素 b (cytochrome b)

　　dPCR:数字 PCR(digitalPCR)

　　PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　qPCR:实时荧光定量 PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)

　　RFLP: 限制性片段长度多态性(restriction fragmentlength polymorphism)

　　4 样品采集与储存

　　4. 1 样品采集

　　4. 1. 1 样品分成两等份 ,作为检样和储存样 。

　　4. 1.2 规范标记编号 ,记录采集时间 、地点 、类型等内容 ,保证样品可追溯 。

　　4. 1.3 样品分别采集 、分别包装 ,注意工具清洁或消毒 , 防止交叉污染 。

　　4.2 抽样

　　4.2. 1 形态特征完整 、可分类识别的同类多个检材 ,按照 GB/Z 31233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行 。

　　4.2.2 具有部分形态特征 、可简单分类的多个检材 ,先分类 ,再按照 GB/Z 31233 中的简单随机抽样或等距抽样规定执行 ;或按照 GB/Z 31233中的分层抽样规定执行 。

　　4.2.3 不具有可识别的形态特征的大批量检材 ,先按照 GB/Z 31233 中的简单随机抽样或等距抽样规定执行 ,结果出现多个物种时 ,再按照 GB/Z 31233中的分层抽样规定执行 。 物种的个体数量可按鉴定结果所占比例核算 。

　　4.3 取样与储存

　　4.3. 1 整体

　　昆虫等小型无脊椎动物可整体取样 ,取适量或整体粉碎 , 收集到离心管或密封袋等储存介质中 , 干燥常温 、冷藏或 -20℃保存 。

　　4.3.2 组织和内脏

　　应先去除易污染的表层 ,宜采取新鲜洁净的组织或内脏 5 mm3 以上 , 收集到离心管或密封袋等储存介质中 ,冷藏暂存 ,宜尽快在 -20℃以下保存 。

　　4.3.3 皮张与蛇蜕等

　　取 1 cm2 以上收集到离心管或密封袋等储存介质中 ,干燥常温 、冷藏或 -20℃保存 。

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　　4.3.4 骨骼与牙齿

　　整体送检或清洗后取不少于 0. 2 g 骨粉或牙粉(组织残留时宜取组织) , 收集到离心管或密封袋等储存介质中 ,干燥常温 、冷藏或 -20℃保存 。

　　4.3.5 皮肤衍生物

　　4.3.5. 1 角、喙、爪、鳞、龟甲等

　　整体送检或清洗后取不少于 0. 2 g 粉 末 等 收 集 到 离 心 管 或 密 封 袋 等 储 存 介 质 中 , 干 燥 常 温 、冷 藏或 -20℃保存 。

　　4.3.5.2 毛、羽等

　　收集 1 根以上置于离心管或密封袋等储存介质中 ,干燥常温 、冷藏或 -20℃保存 。

　　注 : 皮肤衍生物是指由皮肤衍生而成的特殊器官 ,如毛 、羽 、喙 、爪 、蹄 、角 、鳞 、鳍 、盾片 、骨板 、龟甲等 。

　　4.3.6 血液(血痕)

　　宜选新鲜全血采集于 EDTA抗凝管或采血卡 。血痕宜用采样拭子等采集 。抗凝管和采样拭子等冷藏或 -20℃保存 ;采血卡晾干 ,常温 、冷藏或 -20℃保存 。

　　4.3.7 尿液

　　用清洁容器或密封袋等收集 1 mL~ 5 mL,密封 ,冷藏或 -20℃保存 。

　　4.3. 8 粪便

　　用消毒的镊子或勺等取整颗或在表层和内层各取不低于 0. 2 g,收集到离心管或密封袋等储存介质中 ,可加干燥剂或保存液 ,常温 、冷藏或 -20℃保存 。

　　4.3.9 分泌物

　　唾液等用消毒的纱布 、棉花或拭子等采集 , 晾干密封常温保存 ;或者直接密封 ,冷藏或 -20℃保存 ;收集足量其他分泌物到离心管或密封袋等储存介质中 ,冷藏保存 ,宜尽快于 -20℃保存 。

　　注 : 分泌物是指由腺体和组织器官分泌的物质 。

　　4.4 运输

　　4.4. 1 样品 宜 尽 快 送 检 。 干 燥 样 品 常 温 运 输 , 鲜 软 组 织 等 易 腐 败 的 样 品 应 冷 藏 (特 殊 时 干 冰 冷 冻)运输 。

　　4.4.2 每个样品应分别包装 ,在样本袋或容器外标记清楚 ,再将各样品放到统一包装袋或盒中 。

　　4.4.3 抗凝管等玻璃容器 ,放入盒内 ,加垫缓冲材料固定 , 防止晃动 、破裂 。

　　4.4.4 包装应防水 、防漏 、密封性良好 。

　　4.4.5 疑似疫病(如禽流感等) 动物样品 ,应先消毒处理后 ,包装按照 NY/T 541—2016 中 7. 2 的规定执行 。

　　3

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　　5 DNA鉴定程序的构成

　　DNA鉴定程序包括 5个操作步骤 ,检材无形态鉴别特征时 ,有 4 大类方法可选 ;检材具有部分形态鉴别特征或理化鉴别指标等时 ,可与之结合进行综合判断 ,程序流程图如图 1所示 。

　　图 1 DNA鉴定程序流程图

　　6 DNA鉴定程序

　　6. 1 样品前处理

　　6. 1. 1 骨、角等

　　用 75%乙醇或去离子水等清洗表面 2 次 ~ 3 次 ,粉碎(必要时脱钙)处理 。

　　6. 1.2 皮张、蛇蜕等

　　新鲜皮张等去除表层 ,剪碎或研磨 。干燥皮张等应先用 75% 乙醇或去离子水等清洗 2次 ~3次 ,缓冲液浸泡去除表层 ,再剪碎或研磨 。

　　6. 1.3 肌肉等组织

　　新鲜干净组织直接剪碎或研磨 。干燥组织应先用缓冲液浸泡 、去除表层 ,再剪碎或研磨 。

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　　6. 1.4 毛、羽等

　　用 75%乙醇 、去离子水等充分清洗 、剪碎 。

　　6.2 DNA提取

　　6.2. 1 提取要求

　　依据检材类型和 DNA物种鉴定目标 ,确定 DNA提取方法 ,应设置空白对照并严防交叉污染 。

　　6.2.2 苯酚氯仿提取法

　　适用于组织 、血液等样品量充足的检材 ,按照 GA/T 383的相关规定执行 。

　　6.2.3 盐析提取法

　　适用于组织 、血液等样品量充足 ,且需要大片段 DNA进行全基因组测序的检材 。

　　6.2.4 吸附柱试剂盒

　　适用于组织 、血液等 样 品 量 充 足 的 检 材 , 毛 、羽 等 微 量 检 材 以 及 粪 便 等 检 材 , 应 严 格 按 照 说 明 书操作 。

　　6.2.5 磁珠法试剂盒

　　适用于毛 、羽等微量检材以及粪便等检材 ,应严格按照说明书操作 。

　　6.2.6 全自动工作站法

　　适用于大批量样品 ,应严格按照仪器说明书操作 。

　　6.2.7 其他提取方法

　　使用等效 DNA提取试剂盒 ,或验证的新方法 。

　　6.3 DNA 纯化

　　可选择高质量纯化试剂盒或同行验证的纯化方法 。

　　6.4 DNA质量评估

　　6.4. 1 分光光度法

　　按照 GB/T 34796方法 ,测定 DNA浓度 ,并判定 DNA纯度 。

　　6.4.2 电泳法

　　评估 DNA 片段大小 ,判断 DNA完整性(见附录 A) 。

　　6.4.3 qPCR法

　　检测样品 目标基因的 Ct值 ,分析 DNA含量 。

　　6.4.4 荧光计法

　　检测与 DNA结合荧光染料的荧光强度 ,定量目标 DNA 的浓度 。

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　　6.5 检测方法

　　6.5. 1 PCR法

　　6.5. 1. 1 通用引物测序法

　　6.5. 1. 1. 1 设置对照

　　应严格设置阴性对照(不加 DNA 的空白对照)与阳性对照(已知物种的 DNA样品 ,必要时) 。

　　6.5. 1. 1.2 扩增与测序

　　确定目标区域(如 DNA条形码 、Cytb基因等) ,选择通用引物(见附录 B) ,按照反应体系和反应程序(见附录 C)进行 PCR扩增 , 电泳检测见附录 A,有扩增产物且与预期大小一致 ,则纯化(按纯化试剂盒操作)或直接测序(混合样品克隆测序) 。如无扩增产物 ,分析原因重新试验 。

　　6.5. 1. 1.3 序列分析

　　使用 BLAST或 CLUSTAL等软件 ,将测序所得有效 DNA 序列与候选物种的标准序列进行序列比对 ,得到序列一致性结果 ;或在数据库中进行序列比对 ,选取一致性最高的序列及其他近缘物种的同源序列 ,构建系统进化树 。

　　注 :多个数据库综合比对 ,包括但不限于自建 标 准 数 据 库 、国 家 动 物 核 酸 数 据 库 以 及 各 专 项 数 据 库 、国 际 的 BOLD和 GenBank数据库等 ,注意甄别其数据的正确性 。

　　6.5. 1. 1.4 结果判定

　　具体结果判定如下 :

　　a) 与单一物种一致性最高 ,且 ≥99% ,判定与已知物种一致 ,判定该检材 “来源于 × × × (物种) ”或“检出 × × ×(物种)DNA成分 ”;

　　b) 与两个及以上物种一致性最高 ,且 ≥99% ,应加测基因 , 或判定该检材 “来源于 × × × (物种)或 × × ×(物种)…… ”或“检出 × × ×(物种)或 × × ×(物种)DNA成分 ”;

　　c) 与单一物种一致性最高 ,且在 90% ~ 99%之间 ,应加测基因 ,如仍未达到 99% ,应谨慎判定 ;

　　d) 或进化树中 ,位于同一单系分支且置信值达 80%以上的物种即为检材所属物种 ,判定该检材“来源于 × × ×(物种) ”或“检出 × × ×(物种)DNA成分 ”;

　　e) 因为检材质量原因 ,未获得有效 DNA,或缺乏比对的标准序列 ,判定 “无法判定 ”或 “无法确定具体物种 ”。

　　6.5. 1.2 特异引物扩增法

　　6.5. 1.2. 1 设置对照

　　应严格设置阳性对照(已知物种的 DNA样品 , 即检材疑似物种的 DNA 样品) 和阴性对照(近缘物种的 DNA 和以无菌去离子水代替 DNA模板的空白对照) 。

　　6.5. 1.2.2 特异扩增

　　选择目标区域(如 DNA 条 形 码 、Cytb基 因 等) , 并 选 择 根 据 物 种 特 异 位 点 设 计 的 物 种 特 异 性 引物 ,确定反应体系和反应程序(见附录 D) ,进行 PCR扩增 ,扩增产物进行电泳检测(见附录 A) 。

　　6.5. 1.2.3 结果判定

　　具体结果判定如下 :

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　　a) 检材与阳性对照有扩增产物 ,产物的大小与 DNA分子量标准比对时与预期大小一致 ,且阴性对照无扩增产物 ,则表示结果阳性 ,判定该检材 “来源于 × × × (物种) ”或 “检出 × × × (物种) DNA成分 ”。若存在疑问可测序验证 。

　　b) 阳性对照有扩增产物 ,且产物的大小与 DNA分子量标准比对时与预期大小一致 ,检材和阴性对照均无扩增 产 物 ; 或 者 检 材 扩 增 产 物 与 预 期 大 小 不 一 致 , 则 表 示 结 果 阴 性 , 判 定 为 “未 检出 × × ×(物种)DNA成分 ”。阴性结果谨慎判别 ,可更换方法验证 。

　　c) 检材 、阳性对照和阴性对照均有扩增产物且产物的大小与 DNA 分子量标准比对时 , 与预期大小一致 ,则表示 试 验 污 染 , 应 分 析 原 因 , 重 新 试 验 。 检 材 、阳 性 对 照 和 阴 性 对 照 均 无 扩 增 产物 ,表示扩增失败 ,应分析原因 ,重新试验 。

　　d) 因为检材质量原因无法获得有效 DNA,判定 “无法判定 ”或 “无法确定具体物种 ”。

　　6.5. 1.3 qPCR探针法

　　6.5. 1.3. 1 设置对照

　　应严格设置阳性对照(已知物种的 DNA样品 , 即检材疑似物种的 DNA样品) 、阴性对照(非疑似物种的 DNA)和空白对照(提取时设置的提取空白对照和以无菌去离子水代替 DNA模板的 PCR 空白对照) 。

　　6.5. 1.3.2 qPCR扩增

　　根据选择的目标区域(如 DNA条形码 、Cytb基因等) ,选择物种特异性引物和荧光探针 ,确定反应体系和反应程序(见附录 E) ,进行 qPCR扩增 。

　　6.5. 1.3.3 结果分析

　　qPCR反应 结 束 后 , 应 设 置 无 效 基 线 范 围 。 基 线 范 围 选 择 在 3 个 ~ 15个 循 环 , 如 果 有 强 阳 性 样本 ,应根据实际情况调整基线范围 。 阈值设置原则以基线刚好超过正常空白对照扩增曲线(无规则的噪声线)的最高点,且 Ct值不出现任何数值为准 。

　　以下条件有一条不满足时 ,试验视为无效 ,应重做 qPCR扩增 :

　　a) 提取空白对照无特异性扩增曲线 ;

　　b) PCR空白对照无特异性扩增曲线 ;

　　c) 阴性对照无特异性扩增曲线 ;

　　d) 阳性对照 Ct值<35。

　　6.5. 1.3.4 结果判断

　　具体结果判定如下 。

　　a) 待测样品 DNA物种特异性扩增的 Ct值<35并有明显扩增曲线 , 阳性对照 、阴性对照和空白对照扩增正常(含内参基因时 ,检测结果也为阳性) ,判定该样品 “检出 × × × (物种) DNA成分 ”或 “来源于 × × ×(物种) ”。若存在疑问可测序验证 。

　　b) 待测样品 DNA物种特异性扩增的 Ct值 > 40, 阳性对照 、阴性对照和空白对照扩增正常(含内参基因时 ,检测结果也为阳性) ,判定该样品 “未检出 × × × (物种) DNA 成分 ”。阴性结果谨慎判别 ,可更换方法验证 。

　　c) 待测样品 DNA成分的物种特异性扩增的 Ct值介于 35~ 40之间 , 阳性对照 、阴性对照和空白对照扩增正常(含内参基因时 ,检测结果也为阳性) , 可加倍 DNA 模板量 ,重复试验 ,如果 Ct值减小并拥有明显扩增曲线 , 阳性对照 、阴性对照和空白对照依然扩增正常(含内参基因时 ,检

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　　测结果也为阳性) , 判定该样品 “检出 × × × DNA 成分 ”。否则判为 “未检出 × × × (物 种) DNA成分 ”。

　　d) 阳性对照 、阴性对照和空白对照皆阴性(含内参基因时 ,检测结果也为阴性) ,试验无效 。

　　e) 因为检材质量原因无法获得有效 DNA,判定 “无法判定 ”或 “无法确定具体物种 ”。

　　6.5. 1.4 数字 PCR法

　　6.5. 1.4. 1 设置对照同 6. 5. 1. 3. 1。

　　6.5. 1.4.2 dPCR扩增

　　根据选择的目标区域(如 DNA条形码 、Cytb基因等) ,选择物种特异性引物和荧光探针 ,确定反应体系和反应程序(见附录 F) ,进行 dPCR扩增 。

　　6.5. 1.4.3 结果分析

　　反应有荧光信号为阳性 ,无荧光信号为阴性 ,软件记录每个样品的阳性和阴性数 。正确度偏差不应超过标准值的 25% ,应符合数字 PCR方法操作指南要求 。

　　6.5. 1.4.4 结果判断

　　具体结果判定如下 :

　　a) 阳性对照 、阴性对照和空白对照扩增正常 ,检材阳性 ,判定该检材 “检出 × × × (物种)DNA成分 ”或 “来源于 × × ×(物种) ”。若存在疑问可测序验证 。

　　b) 阳性对照 、阴性对照和空白对照扩增正常 ,检材阴性 ,判定该检材 “未检出 × × × DNA成分 ”。阴性结果谨慎判别 ,可测序验证物种 。

　　c) 因为检材质量原因无法获得有效 DNA,判定 “无法判定 ”或 “无法确定具体物种 ”。

　　6.5. 1.5 PCR-RFLP法

　　6.5. 1.5. 1 PCR扩增

　　根据预判的物种范围和选择的目标基因 ,选择物种特异性引物或通用引物 ,确定反应体系和反应程序(见附录 C) ,进行 PCR扩增 , 电泳检测 ,若扩增产物片段大小正确 ,则进行下一步酶切反应 。

　　6.5. 1.5.2 酶切反应

　　根据特异位点选择限制性内切酶 ,按该酶说明书反应条件酶切 。

　　6.5. 1.5.3 结果判断

　　酶解产物进行电泳检测 ,酶切片段数量和大小与目标物种预期一致 ,判定该检材为 “检出 × × ×(物种)DNA成分 ”或 “来源于 × × ×(物种) ”。否则 ,判定该检材 “未检出 × × × (物种)DNA成分 ”。若有疑问可更换方法验证 。 因为检材质量原因无法获得有效 DNA,判定“无法判定”或 “无法确定具体物种”。

　　6.5. 1.6 其他 PCR法

　　巢式 PCR、溶解曲线法等 PCR方法 , 以及公开发表在权威专业性期刊上的其他基于 PCR 的 DNA物种鉴定方法 ,应经专家组评估 、验证后使用 。依据标准程序进行操作 。

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　　6.5.2 等温扩增法

　　环介导等温扩增技术 、重组酶聚合酶扩增技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术等方法 ,应经专家组评估 、验证后使用 ,依据方法验证的标准程序进行操作 。

　　注 : 等温扩增法是一类分子生物学技术的总称 ,在某一特定的温度下 ,扩大核酸的拷贝数 。

　　6.5.3 基因组测序法

　　6.5.3. 1 DNA 文库构建

　　DNA文库要基于被行业内广泛认可的测序平台的标准流程进行构建 。

　　6.5.3.2 测序

　　基于文库构建方法 ,选择使用合适的测序平台进行全基因组测序 。应严格把控测序质量 。测序质量可以通过多种指标来评估 ,包括 Q20、Q30和 N 区比例等 。还应考虑测序深度和测序覆盖度 。一般测序深度宜大于 5倍 。

　　注 : 全基因组测序是指对生物检材进行整个基因组测序 ,包括长读长测序和短读长测序 ,用以获得物种完整的基因组序列信息 。

　　6.5.3.3 合适基因组区域的确定

　　待测样本与其他物种进行序列的比较分析时(如构建系统进化树等) ,应选取各物种中的同源区域 。一般宜过滤掉性染色体区域以及基因区 ,选择进化中性区域 。

　　6.5.3.4 全基因组物种鉴定分析

　　选取疑似物种或其近缘物种的高质量基因组作为参考基因组 ,将待测个体与其他候选物种的测序数据比对到参考基因组上 ,进行遗传变异的检测 ,筛选出高质量 SNP(单核苷酸多态性) 位点,通过物种特异位点比较分析 ,或构建系统进化树 ,完成鉴定分析 。

　　6.5.3.5 结果解读

　　结果与目标物种预期相符 ,判定该检材 “检出 × × ×(物种)DNA成分 ”或 “来源于 × × ×物种 ”。否则 ,判定该检材 “未检出 × × ×(物种)DNA成分 ”或 “非来源于 × × ×物种 ”。因为检材质量原因无法获得有效 DNA,判定 “无法判定 ”或 “无法确定具体物种 ”。

　　6.5.4 其他 DNA 方法

　　芯片法以及利用新技术开发的 DNA物种鉴定方法 ,经同行专家组评估 、验证后 ,形成标准程序 ,可使用 。

　　6.5.5 综合判断

　　具有部分形态鉴别特征的检材 ,上述 DNA结果可以结合形态学特征综合判断 ;还可以结合地理分布 、理化鉴别指标等综合判断 。

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　　GB/T 43650—2024

　　7 结果表述

　　7. 1 “× × × ”检材“来源于 × × ×(物种) ”或“检出 × × ×(物种)DNA成分 ”。

　　7.2 “× × × ”检材 “为 × × ×(物种) × × ×(制品名称)(结合形态或理化指标时) 。

　　7.3 “× × × ”检材 “来 源 于 × × × (物 种) 或 × × × (物 种) . . . . . . ”或 “检 出 × × × (物 种) 或 × × × (物种) . . . . . . DNA成分 ”。

　　7.4 “× × × ”检材 “未检出 × × × (物种)DNA成分 ”。

　　7.5 “× × × ”检材 “无法判定 ”或 “无法确定具体物种 ”。

　　8 追溯方法

　　8. 1 标记方法

　　在执行 4. 3 和 6. 1 过程中 ,标记的内容包括 :样品编号 、取样日期 、样品类型 、其他 。在执行第 6章其他过程中标记样品编号 。

　　8.2 过程记录

　　在执行第 6章所规定的程序过程中 ,记录并保持以下内容 :

　　执行各程序的人员姓名 、操作日期 、执行的操作内容 、操作的结果或观察到的现象 、其他 。

　　9 污染预防与处理

　　按照 LY/T 2501的相关规定执行 。

　　10 实验室区域设置

　　按照 LY/T 2501的相关规定执行 。

　　11 仪器和试剂要求

　　按照 LY/T 2501的相关规定执行 。

　　12 实验室清洁

　　按照 GB/T 19495. 2 的相关规定执行 。

　　13 安全防护

　　按照 LY/T 2501和 GB/T 19495. 2 的相关规定执行 。

　　14 废弃物处理

　　按照 GB 19489的相关规定执行 。

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　　附 录 A (资料性)

　　电泳检测程序

　　A. 1 常规电泳检测法

　　A. 1. 1 试剂与仪器

　　A. 1. 1. 1 10×载样缓冲液 :溴酚蓝 、二甲苯腈蓝 、聚蔗糖 。

　　A. 1. 1.2 50×TAE缓冲液 :Tris、乙酸钠 、EDTA。

　　A. 1. 1.3 核酸荧光染料 。

　　A. 1. 1.4 琼脂糖 。

　　A. 1. 1.5 DNA标准分子量 ,根据具体需要选用 。

　　A. 1. 1.6 电泳仪器 。

　　A. 1. 1.7 微量移液器 。

　　A. 1. 1. 8 紫外透射仪或凝胶成像系统 。

　　A. 1. 1.9 微波炉 。

　　A. 1. 1. 10 电子天平 。

　　A. 1.2 步骤

　　A. 1.2. 1 配制琼脂糖凝胶

　　A. 1.2. 1. 1 配制 1× TAE缓冲液

　　取 50×TAE缓冲液 20 mL,加水至 1 000 mL,配制成 1×TAE稀释缓冲液 ,待用 。

　　A. 1.2. 1.2 胶液的制备

　　称取 1 g琼脂糖 ,置于 200 mL锥形瓶中 ,加入 100 mL 1×TAE稀释缓冲液 ,放入微波炉加热至琼脂糖全部溶化 ,取出摇匀 ,为 1%琼脂糖凝胶液 。

　　A. 1.2. 1.3 胶板的制备

　　胶板制备步骤如下 。

　　a) 将胶槽置于水平支持物上 ,插上样品梳 。

　　b) 琼脂糖胶液冷却至 50 ℃ ~ 60 ℃ ,加入 10 μL核酸荧光染料(如 SYBR Green、SYBR Gold等)溶液使其终浓度为 1/10000(根据染料不同可调整) ,轻轻摇匀(也可取 1 μL~ 2 μL染料工作液和 5 μL电泳样品混匀静置 5 min直接上样) 。慢慢地倒入胶槽内 ,使胶液形成均匀的胶层 。检查并排除气泡 。

　　c) 室温下静置 30 min ~45 min,待琼脂糖溶液完全凝固 ,垂直拔出样品梳 ,注意不要损伤梳底部凝胶 ;将凝胶放入电泳槽中 。

　　d) 加入电泳缓冲液(1×TAE)至电泳槽中 ,使液面高于胶面 。

　　A. 1.2.2 加样

　　取 9 μL检测样品与 1 μL (1/10体积)的 10×DNA上样缓冲液混匀 ,用微量移液器小心加入样品

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　　槽中 。避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿 。

　　A. 1.2.3 电泳

　　接通电泳仪电源 ,按照需要调节电压 , 电泳开始 ,观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝有气泡出现 。根据片段大小电泳 15 min ~ 30 min,关闭电源 。

　　A. 1.2.4 观察结果

　　取出凝胶 ,在波长为 302 nm(或 365 nm) 紫外光下观察 。DNA 存 在 处 显 示 出肉 眼 可 辨 的 荧 光 条带 。观察时应有防护 , 以免损伤眼睛 。

　　A.2 芯片电泳检测法

　　按仪器说明书操作 。

　　A.3 其他电泳检测法

　　按各透射仪的仪器说明书操作 。

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　通用引物序列信息

　　B. 1 Cytb基因通用引物

　　mcb398:5'-TACCATGAGGACAAATATCATTCTG-3'

　　mcb869:5'-CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG-3'

　　PCR产物 472 bp,可扩增脊椎动物和无脊椎动物(Verma & Singh, 2003) 。

　　L14724:5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3'

　　H15149:5'-CTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3'

　　PCR产物约 442 bp, 可扩增脊椎动物(Kocher etal. 1989) 。

　　L14841:5'-AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGAAA-3'

　　H15149:5'-CTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3'

　　PCR产物约 381 bp, 可扩增脊椎动物(Kocher etal. 1989) 。

　　L14724:5'-GATATGAAAAACCATCGTTG -3'

　　H15915:5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3'

　　PCR产物约 1 140 bp, 可扩增脊椎动物(Xiao etal. 2001) 。

　　B.2 COI基因通用引物

　　LCO1490:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'

　　HCO2198:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'

　　PCR产物约 750 bp, 可扩增脊椎动物和无脊椎动物(Folmeretal. 1994) 。

　　FishF1:5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'

　　FishR1:5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3'

　　PCR产物约 710 bp,可扩增鱼类(Ward etal. 2005) 。

　　B.3 12SrRNA 基因通用引物

　　L1091:5'-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3'

　　H1478:5'-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3'

　　PCR产物 440 bp,可扩增脊椎动物(Kocher etal. 1989;DelPero etal. 2000) 。

　　B.4 16SrRNA 基因通用引物

　　16SA:5'-GTGCAAAGGTAGCATAATCA -3'

　　16SB:5'-TGTCCTGATCCAACATCGAG-3'

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　　GB/T 43650—2024

　　PCR产物约 440 bp,可扩增脊椎动物和无脊椎动物(Ramadan, 2011) 。

　　16SAR: 5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3'

　　16S BR:5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3'

　　PCR产物长约 572 bp,可扩增脊椎动物和无脊椎动物(Inoue etal. 2001) 。

　　16S-F:5'-TRACTGTRCAAAGGTAGC-3'

　　16S-R:5'-TTAATTCAACATCGAGGTC-3'

　　PCR产物 392bp,可扩增脊椎动物和无脊椎动物(Schulmeister, 2003) 。

　　J12888:5'-CCGGTCTGAACTCARATCATGTA-3'

　　N13889:5'-ATTTATTGTACCTTKTGTATCAG-3'

　　PCR产物 1049bp,可扩增脊椎动物和无脊椎动物(Simon etal. 2006) 。

　　注 : 根据发表文献等公开信息进行验证 、补充引物 。

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　通用引物 PCR反应体系与反应程序

　　C. 1 反应体系

　　50 μL含 10×buffer5 μL、10 mmol/L dNTP 4 μL、10 μmol/L上下游引物各 1 μL、DNA 聚合酶2 U~ 10 U、DNA模板 10 ng~ 100 ng,灭菌去离子水补足反应体系总体积至 50 μL。或按表 C. 1。

　　表 C. 1 反应体系

　　试剂

　　加样量(50μL反应体系)

　　ddH2 O

　　调整至终体积 50 μL

　　Taq Mix (2×)

　　25 μL

　　Primer1 (10 μmol/L)

　　1 μL

　　Primer2 (10 μmol/L)

　　1 μL

　　DNA

　　10 ng~ 100 ng

　　注 : 预试验反应体系减为 20 μL。

　　C.2 反应程序

　　C.2. 1 COI基因

　　LCO1490/HCO2198:

　　94 ℃/5 min; (94 ℃/30 s, 45℃ → 50 ℃/30 s, 72 ℃/60 s) 6 个 循 环 ; (94 ℃/30 s, 52 ℃/30 s, 72 ℃/60 s) 35个循环;72 ℃/5 min。

　　FishF1/FishR1:

　　94 ℃/5 min; (94 ℃/30 s,52 ℃/30 s,72 ℃/60 s)35个循环;72 ℃/5 min。

　　C.2.2 Cytb基因

　　L14724/H15149和 L14841/H15149:

　　94 ℃/5 min; (94 ℃/30 s,52 ℃/30 s,72 ℃/30 s)35个循环;72 ℃/5 min。

　　L14724/H15915:

　　94 ℃/5 min; (94 ℃/30 s,52 ℃/30 s,72 ℃/60 s)35个循环;72 ℃/5 min。

　　C.2.3 12SrRNA 基因

　　12SA/12SB:

　　94 ℃/5 min; (94 ℃/30 s,52 ℃/30 s,72 ℃/30 s)35个循环;72 ℃/5 min。

　　C.2.4 16SrRNA 基因

　　94 ℃/3 min; (94 ℃/30 s,50 ℃ ~ 68 ℃/30 s,72 ℃/45 s)35个循环;72 ℃/5 min。

　　注 : 变性温度和退火 、延伸时间根据不同的 引 物 、DNA 聚 合 酶 或 Taq Mix作 调 整 。如 果 调 整 退 火 温 度 ,需 经 过 试验确认 。

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　　附 录 D

　　(资料性)

　　特异性 PCR 的引物、反应程序与反应体系

　　D. 1 高鼻羚羊(Saigatatarica)特异引物

　　D. 1. 1 引物序列

　　SaigaBF:5'-CTTAGCCCTAGCAGCAGTCC-3'

　　SaigaBR:5'-AGGGCTAAAACCCCTCCTAGT-3'

　　PCR产物约 321 bp(张晓璐等 ,2006) 。

　　D. 1.2 反应程序

　　94 ℃/5 min; (94 ℃/30 s,58 ℃/30 s,72 ℃/30 s)35个循环;72 ℃/5 min。 D. 1.3 反应体系

　　反应体系见表 D. 1。

　　表 D. 1 反应体系

　　试剂

　　加样量(20μL反应体系)

　　ddH2 O

　　调整至终体积 20 μL

　　Taq Mix (2×)

　　10 μL

　　Primer1 (10 μmol/L)

　　0. 4 μL

　　Primer2 (10 μmol/L)

　　0. 4 μL

　　DNA

　　10 ng~ 100 ng

　　注 : 变性温度和退火 、延伸时间根据不同的 Taq Mix

　　做调整 。如果调整退火温度 ,需经过试验确认 。

　　D.2 雪豹(Pantherauncia)特异引物

　　D.2. 1 引物序列

　　SCT-PUN-F:5'-TGGCTGAATTATCCGATACC-3'

　　SCT-PUN-R:5'-AGCCATGACTGCGAGCAATA-3'

　　PCR产物 151 bp(Janecka etal, 2014) 。

　　D.2.2 反应程序

　　94 ℃/5 min; (94 ℃/30 s,60 ℃/30 s,72 ℃/30 s)35个循环;72 ℃/5 min。 D.2.3 反应体系

　　同 D. 1. 3。

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　　D.3 豹(Panthera pardus)特异引物

　　D.3. 1 引物序列

　　Ppo-CbF:5'-GTAAATTATGGCTGAATTATCCGG-3'

　　Ppo-CbR:5'-CATAACCGTGAACAATAATACGAC-3'

　　PCR产物 156bp(Sugimoto etal, 2006) 。

　　D.3.2 反应程序

　　94 ℃/5 min; (94 ℃/30 s,60 ℃/45 s,72 ℃/45 s)35个循环;72 ℃/5 min。

　　D.3.3 反应体系同 D. 1. 3。

　　D.4 虎(Pantheratigris)特异引物

　　D.4. 1 引物序列

　　Pta-CbF:5'-TTTGGCTCCTTACTAGGGGTG-3'

　　Pta-CbR:5'-CCGTAAACAATAGCACAATCCCGATA-3'

　　PCR产物 271 bp(Sugimoto etal, 2006) 。

　　D.4.2 反应程序

　　94 ℃/5 min; (94 ℃/30 s,60 ℃/45 s,72 ℃/45s)35个循环;72 ℃/5 min。

　　D.4.3 反应体系同 D. 1. 3。

　　D.5 黑熊(Ursusthibetanus)特异引物

　　D.5. 1 引物序列

　　Ut172f:5'-GACGCGACTACAGCCTTTTC-3'

　　Ut367r:5'-CTATGAATGCGGTGGCTATAAC-3'

　　PCR产物约 217bp(Peppin etal,2008) 。

　　D.5.2 反应程序

　　94 ℃/5 min; (94 ℃/30 s,60 ℃/45 s,72 ℃/45 s)35个循环;72 ℃/5 min。

　　D.5.3 反应体系

　　同 D. 1. 3。

　　注 : 根据发表文献等公开信息进行验证 、补充引物 。

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　　附 录 E

　　(资料性)

　　qPCR反应体系与反应程序

　　E. 1 反应体系

　　20 μL含 2×qPCR mix (Rox) 10 μL、10 μmol/L上下游引物各 0. 5 μL、10 μmol/L物种特异荧光探针 0. 5 μL、DNA模板 10 ng~ 100 ng,灭菌去离子补足反应体系总体积至 20 μL。

　　注 1: qPCR mix使用等效品牌试剂 。引物和荧光探针的使用量根据具体物种及靶基因进行优化 、调整和确认 。

　　注 2: 每个样品设置 2个平行样 。

　　E.2 反应程序

　　95 ℃/10min;95 ℃/10 s,60 ℃/30 s, (40个 ~ 50个) 循 环 ; 60 ℃/min。 循 环 在 退 火 时 收 集 荧 光信号 。

　　注 : 不同仪器根据仪器要求 ,或根据不同物种鉴定方法调整循环参数 。

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　　附 录 F

　　(资料性)

　　dPCR反应体系与反应程序

　　F. 1 反应体系

　　20 μL体系含 2× ddPCR Supermix for probes 10 μL、10 μmol/L上下游引物各 1 μL、10 μmol/L物种特异荧光探针 1 μL、DNA模板 10 ng~ 100 ng,无菌去离子水补足反应体系总体积至 20 μL。

　　注 : ddPCR Supermix for probes,使用等效试剂 。

　　F.2 反应程序

　　95 ℃/3min;94℃/30 s, (55 ℃ ~ 68 ℃)/30 s, (40个 ~ 60个)循环 。

　　注 : 不同仪器根据仪器要求或不同物种鉴定方法调整参数 。

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　　参 考 文 献

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