DB63/T 2427-2025 无浆体病防控技术规范

　　青海省地方标准

　　DB 63/T 2427—2025

　　无浆体病防控技术规范

　　2025 - 06 - 30 发布 2025 - 08 - 01 实施

　　青海省市场监督管理局 发布

　　前 言

　　本文件按照GB/T 1.1一2020《标准化工作导则 第Ⅰ部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

　　起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由青海省农业农村厅提出并归口。

　　本文件起草单位：青海省动物疫病预防控制中心，贵德县动物疫病预防控制中心。

　　本文件起草人：阚威、郑思思、巨金玲、逯玉、蔡金山、张立成、游潇倩、谢得军、马艳萍、苏宏

　　青、陶景莲、曾占豪、李静、林元清、马金林、多杰才旦、陈峰、马占军、魏梦君、辛莉、孙生祯、李

　　秀英、宋维芳。

　　本文件由青海省农业农村厅监督实施。

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　　无浆体病防控技术规范

　　1 范围

　　本文件规定了无浆体病防控技术的术语和定义、病原、流行病学、临床症状、病理剖检变化、诊断

　　和综合防控等内容。

　　本文件适用于无浆体病的防控。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

　　仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本

　　文件。

　　NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　无浆体

　　无浆体(Anaplasma)，隶属于立克次体目(Rickettsiales)无浆体科(Anaplasmataceae)无浆体属

　　(Anaplasma)，是通过蜱等吸血昆虫传播的一类专性细胞内寄生病原体，其主要寄生于羊、牛和鹿等

　　动物的血液细胞中。

　　3.2

　　无浆体病

　　无浆体病(Anaplasmosis)是由无浆体引起动物的一种慢性和急性传染病，其特征为发热、贫血、

　　黄疸、胆囊肿胀和进行性消瘦。

　　3.3

　　蜱传病

　　以寄生在动物体表、吸取宿主血液的蜱虫作为传播媒介，将蜱虫携带的致病性病原体通过叮咬易感

　　动物而是其感染相应的疾病。

　　4 病原

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　　无浆体无细胞壁，具多形性，如球形、环形、杆状等，大小约0.3 μm～1.0 μm，革兰氏(Gram)染

　　色阴性，姬姆萨(Giemsa)染色呈紫红色，在宿主红细胞内寄生时呈单个或多个存在，常位于红细胞

　　边缘或中央。

　　5 流行病学

　　5.1 传染源为感染无浆体的病畜。

　　5.2 传播途径主要是通过媒介昆虫叮咬动物皮肤感染。媒介昆虫主要是蜱，还包括牛虻、蝇和蚊等多

　　种吸血昆虫。被污染且消毒不彻底的手术器械、注射器、针头等也可机械性传播本病。

　　5.3 羊、牛和鹿等动物易感。幼畜易感性低，1 岁以上动物易感。

　　5.4 该病有明显的季节性，多在高温季节发生。随着蜱虫的活跃暴发，6 月份开始流行，8～10 月为流

　　行高峰，11 月份个别病例散在发生。

　　6 临床症状

　　潜伏期为20 d～30 d。病畜体温升高至40 ℃～42 ℃、衰弱无力、贫血、黄疸、萎顿、厌食、消瘦、

　　尿液清亮常起泡沫等临床症状。

　　7 病理剖检变化

　　腹腔内肝脏呈黄色，胆囊扩张，胆汁充盈;脾脏肿大3～4倍，髓质变脆如果酱;肠系膜淋巴结肿大、

　　水肿;胃有出血性炎症;肠道有卡他性炎症。胸腔内有少量渗出液;心脏肿大，心包积液，心冠状脂肪

　　和心肌出血，心内外膜下和其他浆膜可见大量瘀斑;肺脏发生气肿;颈部、胸下与腋下的皮下轻度水肿;

　　血液稀薄。

　　8 诊断

　　8.1 初步诊断

　　根据流行病学、临床症状、病理剖检变化做出初步诊断。

　　8.2 实验室诊断

　　8.2.1 血液镜检

　　8.2.1.1 采集可疑病畜静脉血制作血涂片，姬姆萨染色红细胞中发现单个或多个无浆体，对红细胞的

　　侵袭率超过0.5 %时，做出阳性诊断。

　　8.2.1.2 血液检查发现红细胞总数减少，血红蛋白和红细胞比容降低。

　　8.2.2 分子生物学诊断

　　8.2.2.1 样本采集

　　无菌抗凝管采集疑似患病畜血液1 ml，4 ℃保存，立即送检;采集蜱及病死畜实质器官组织样本，

　　待检备用。

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　　8.2.2.2 样本运输和保存

　　按照NY/T 541执行，对不立即检测样本可存于-20 ℃以下保存。

　　8.2.2.3 样本处理

　　将蜱浸泡于75 %酒精，15 min，1倍磷酸盐缓冲液或0.9 % NaCl溶液洗3次，置于干净的滤纸上吸水

　　干燥，干燥后取同种蜱5只。无菌取黄豆大小的组织样本(约50 mg)。将以上样本加入适量1倍Tris-EDTA

　　缓冲液250 μL研磨至匀浆状，4 ℃保存备用。血液(200 μL)无需处理可直接用于核酸提取。1倍磷酸盐

　　缓冲液、1倍Tris-EDTA缓冲液配置方法见附录A。

　　8.2.2.4 样本DNA 提取

　　取上述样本的匀浆液或血液样本200 μL加入200 μL DNA提取液充分混匀，沸水浴8 min(误差不超

　　过1 min)，1200 r/min离心10 min，取上清作为模板备用。或按照商品化微量DNA提取试剂盒说明书操

　　作提取DNA，保存于-20 ℃备用。DNA提取液配置方法见附录A。

　　8.2.2.5 PCR 扩增

　　见附录B。

　　8.3 确诊

　　结合本文件8.1和8.2，做出确诊。

　　8.4 鉴别诊断

　　应与其他贫血症、血液原虫病相鉴别。

　　9 综合防控

　　9.1 预防

　　9.1.1 饲养管理

　　提供优质饲料和充足的饮水。

　　9.1.2 消毒灭蜱

　　在蜱活跃季节，对畜群体表、圈舍及圈舍周围环境定期进行消毒灭蜱，消毒灭蜱方法见附录C。

　　9.1.3 调运管理

　　调运动物时应对该病及其体表可能存在的传播媒介进行检查，排除可疑病畜。

　　9.2 治疗

　　病畜应隔离治疗，治疗方法见附录D。

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　　AA

　　附 录 A

　　(资料性)

　　缓冲液配方及制法

　　A.1 1 倍磷酸盐缓冲液

　　A.1.1 取NaCl 8 g、KCl 0.2 g、NaHPO4 1.44 g、KHPO4 0.24 g放入烧杯中;

　　A.1.2 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，用玻璃棒搅拌或使用磁力搅拌器搅拌，使药品完全溶解;

　　A.1.3 调节pH值至7.2-7.4;

　　A.1.4 将溶液定容至1000 ml后，高温高压灭菌，室温保存，备用。

　　A.2 1 倍Tris-EDTA缓冲液

　　A.2.1 取1M Tris-HCl Buffer PH=8.0，5 ml和0.5 M EDTA，PH=8.0，1 ml;

　　A.2.2 向烧杯中加入约400 ml ddH2O均匀混合;

　　A.2.3 将溶液定容到500 ml后，高温高压灭菌，室温保存，备用。

　　A.3 DNA提取液

　　A.3.1 配制提取液之前，先配制母液

　　母液(灭菌)：1 M Tris-HCl(12.11 gTris-HCl+ ddH2O至100 ml，用浓盐酸调pH值至8.0;0.5 M

　　EDTA-Na2.2H2O(37.22 g+ddH2O至200 ml，用NaOH调pH值为8.0;5 M NaCl (58.4 g加ddH2O制成200 ml

　　溶液)。

　　A.3.2 提取液配方

　　配置100 ml，需加入：CTAB粉剂2 g，1 M Tris-HCl (pH8.0) 10 ml，0.5 M EDTA(pH8.0) 4 ml，5

　　M NaCl 28 ml，PVP 1 g，β-巯基乙醇1 ml，加双蒸水定容至100 ml，备用。

　　A.4 1 倍Tris-乙酸-EDTA缓冲液

　　先配制50倍Tris-乙酸-EDTA缓冲液，用时稀释成1倍工作液。50倍Tris-乙酸-EDTA缓冲液的配制方

　　法为：取Tris 242 g，EDTA-Na2.2H2O 37.2 g，加入约600 mL的去离子水，充分搅拌溶解，再加入57.1

　　mL的醋酸，充分搅拌，加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存;1倍Tris-乙酸-EDTA缓冲液，取50

　　倍Tris-乙酸-EDTA缓冲液20 ml，加ddH2O定容至1 L，备用。

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　　BB

　　附 录 B

　　(资料性)

　　PCR 扩增

　　B.1 扩增方法

　　采用普通PCR扩增，用无浆体属特异性基因rpoB(RNA聚合酶β亚基)进行鉴定，试验所用引物、

　　反应体系、扩增程序如下：

　　——无浆体属特异性基因rpoB 引物序列：见表B.1;

　　——引物浓度均配制成10 μmol/L;

　　——PCR 反应体系，见表B.2;

　　——PCR 扩增程序：95 ℃预变性15 min;94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，

　　35 个循环;72 ℃延伸10 min，反应中设立阴性对照、阳性对照和空白对照。

　　表B.1 无浆体扩增引物

　　名称 靶基因 引物名称 5′-3′序列 退火温度 片段大小

　　Ana-rpoBF GCTGTTCCTAGGCTYTCTTACGCGA

　　无浆体属 rpoB gene

　　Ana-rpoBR AATCRAGCCAVGAGCCCCTRTAWGG

　　58 ℃ 525 bp

　　注：R、V、W，为兼并碱基，R=A/G，V=A/G/C，W=A/T。

　　表B.2 PCR 反应体系

　　组分 1 个扩增体系加入量

　　2×PCR mix 12.5 μL

　　上游引物 1 μL

　　下游引物 1 μL

　　模板 2 μL

　　无菌无核酸酶水 8.5 μL

　　总体系 25 μL

　　B.2 电泳

　　制备1 %琼脂糖凝胶，将核酸扩增产物及DNA Maker加入胶孔，将凝胶放入电泳槽中，加入足量的1

　　倍Tris-乙酸-EDTA缓冲液，使凝胶完全浸没，接通电源，电压为120 V～150 V，电泳时间30 min～40 min。

　　1倍Tris-乙酸-EDTA缓冲液配置方法见附录A。

　　B.3 结果判定

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　　阴性对照、空白对照未出现条带，阳性对照在525 bp有扩增条带，即试验成立。如待检样品PCR扩

　　增产物电泳检测结果未出现预期大小的扩增条带，则判定该检测样本的PCR检测结果为阴性;如待检样

　　品PCR扩增产物电泳检测出现525 bp的扩增条带，则判定该检测样本的PCR检测结果为阳性，见图B.1。

　　图B.1 无浆体病靶基因rpoB PCR 扩增图

　　注：M—DNA 分子质量标准Trans2000;

　　1—阳性对照(牛边缘无浆体(临洮株));

　　2—阳性样本(羊全血无浆体测序阳性);

　　3—阴性对照(生理盐水);

　　4—空白对照。

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　　CC

　　附 录 C

　　(资料性)

　　消毒灭蜱

　　表C.1给出了消毒灭蜱方法。

　　表C.1 消毒灭蜱方法

　　药物名称 消毒区域 消毒方法 用法用量

　　0.05 %辛硫磷混悬液 圈舍 喷洒 1 周～2 周消毒一次

　　1 %敌百虫溶液 动物体表 喷洒 1 周～2 周消毒一次

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　　DD

　　附 录 D

　　(资料性)

　　治疗药物及方法

　　表D.1给出了治疗药物及方法。

　　表D.1 治疗药物及方法

　　防控方法 药物名称 给药途径 给药剂量 使用方法 注意事项

　　土霉素 口服或肌注 每公斤体重 10 mg 连用 12 d～16 d /

　　金霉素 口服或肌注 每公斤体重 15 mg 连用 12 d～16 d /

　　治疗

　　25 %葡萄糖+维

　　生素C 注射液/内服

　　氯氰碘柳胺钠和阿

　　维菌素合剂

　　静脉注射+内服

　　羊剂量：25 %葡萄糖

　　150 ml 5 %维生素C 注

　　射液4 ml(牛剂量为

　　羊的3 倍);合剂氯氰

　　碘柳胺钠和阿维菌素

　　内服(每1 kg 体重，

　　牛、羊0.1 片)。

　　静脉注2 次/ d，连用

　　3 d，待患畜精神好转，

　　食欲恢复后用合剂(氯

　　氰碘柳胺钠和阿维菌

　　素)1 次，2 周后，再

　　用合剂(氯氰碘柳胺钠

　　和阿维菌素)1 次。

　　合剂氯氰碘柳胺

　　钠和阿维菌素，

　　每片含氯氰碘柳

　　胺钠50 mg，阿

　　维菌素3 mg。

　　驱虫

　　对同群动物用阿苯达唑伊维菌素片，每10 kg 体重，0.27 g～0.36 g 灌服，同时用螨净溶液喷洒动物体表和

　　圈舍。

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　　参 考 文 献

　　[1]Dahmani,M.,Davoust,B.,Rousseau,F.,Raoult,D.,Fenollar,F.,Mediannikov,O.,2017.Natural Anaplasmataceae

　　infection in Rhipicephalus bursa ticks collected from sheep in the French Basque Country. Ticks Tick.

　　Borne.Dis. 8, 18–24.

　　[2]He, Y., Chen, W., Ma, P., Wei, Y., Li, R., Chen, Z., Tian, S., Qi, T., Yang, J., Sun, Y., Li, J., Kang, M., &

　　Li,Y. (2021). Molecular detection of Anaplasma spp., Babesia spp. and Theileria spp. in yaks (Bos grunniens)

　　andTibetan sheep (Ovis aries) on the Qinghai-Tibetan Plateau, China. Parasites & vectors,14(1), 613.

　　[3]彭永帅,宁长申.无浆体检测技术研究现状[J].动物医学进展,2023,44(03):113-116.

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