DB32/T 5425-2026 南方水稻黑条矮缩病毒免疫斑点检测方法

ICS 65.020 CCS B 16

江苏 省地 方标 准

DB32/T 5425—2026

南方水稻黑条矮缩病毒免疫斑点

检测方法

Detection method of southern rice black⁃streaked dwarf virus by

dot immunobinding assay

2026-07-20 发布 2026-08-20 实施

江苏省市场监督管理局发 布

DB32/T 5425—2026

前言

本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由江苏省农业农村厅提出并组织实施。

本文件由江苏省农作物标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：江苏省农业科学院、江苏省植物保护植物检疫站。

本文件主要起草人：周彤、朱凤、杜琳琳、李晨羊、周晨、张海波、梁修成、许津铭、潘俍辰、赵忆宁、张玉、段云辉。

Ⅲ

1 范围

本文件描述了采用免疫斑点法检测南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)的方法。

本文件适用于南方水稻黑条矮缩病的诊断、监测与流行学调查。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4 试剂和材料

试验用水均为 GB/T 6682 规定的三级水。

4.1 碳酸盐包被液。0.05 mol/L，pH=9 .6，称取 1.59 g Na2 CO3 和 2.93 g NaHCO3，加水定容至 1 000 mL，用 HCl 调 pH 至 9.6，4 ℃保存。

4.2 磷酸盐 Tween⁃20 缓冲液(PBST)。0.01 mol/L，pH=7 .5，称取 40 g NaCl，1 g KCl，1 g KH2PO4 和15 g Na2HPO4，加水定容至 5 000 mL，用 HCl 调节 pH 至 7.5，再加入 2.5 mL Tween_20，4 ℃保存。

4.3 磷酸 盐缓 冲液(PBS)。 0.02 mol/L，pH=7 .5，称取 40 g NaCl，1 g KCl，1 g KH2PO4 和 15 g Na2HPO4，加水定容至 2 500 mL，用 HCl 调节 pH 至 7.5，4 ℃保存。

4.4 2% 脱脂奶粉封闭液。2 g 脱脂奶粉加入 100 mL 磷酸盐 Tween_20 缓冲液中，4 ℃保存。

4.5 单克隆抗体(单抗)。南方水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体，效价为 1∶5 000~1∶10 000，-20 ℃保存。

4.6 碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠 IgG 二抗。 -20 ℃保存。

4.7 辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠 IgG 二抗。 -20 ℃保存。

4.8 NBT/BCIP 显色底物。

4.9 TMB 显色底物。

4.10 硝酸纤维素膜(NC 膜)。

4.11 水稻对照。 田间采集疑似感染 SRBSDV 的水稻植株，一步双重 RT_PCR(见附录 A)检测为阳性的水稻叶片为检测水稻阳性对照，-20 ℃保存。健康水稻叶片为检测水稻阴性对照。

4.12 白背飞虱对照。温室内饲养、扩繁的白背飞虱种群饲喂感染 SRBSDV 的水稻 4 d~6 d，再在健康水稻苗上饲养 8 d~10 d，随机取 10 头混样，一步双重 RT_PCR 检测为阳性的白背飞虱群体为检测白背飞虱阳性对照，-20 ℃保存。不携带 SRBSDV 白背飞虱为检测白背飞虱阴性对照。

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5 仪器设备

5.1 台式离心机。转速不低于 5 000 r/min。

5.2 微量天平。精确到 0.001 mg。

6 植物样品检测

6.1 样品制备

田间采集新鲜水稻植株的茎秆或叶片，装至无菌样品袋中。标记样品编号、取样时间、取样地点， 48 h 内送至实验室，放置-20 ℃冰箱保存备用，避免反复冻融。

取 0.5 mg 水稻植株的茎秆或叶片研磨成粉末，用碳酸盐包被液稀释 100 倍，离心 3 min，取上清液备用。

6.2 点样

在 NC 膜上画出方格阵列，每个方格大小 5 mm× 5 mm，取 2 µL 上清液(6 .1)点于 NC 膜上正方格中心(以不超出正方格一半为准);同时分别取 2.0 µL 水稻阳性对照、阴性对照点于 NC 膜上，将 NC 膜置于室温晾干 10 min。

将干燥的 NC 膜置于玻璃培养皿内，加入 2% 脱脂奶粉封闭液，要求将 NC 膜完全浸没，放入 37 ℃摇床轻轻摇晃(转速 70 r/min)30 min。

6.3 一抗孵育

用镊子压住 NC 膜倒弃封闭液，将 SRBSDV 单抗用 2% 脱脂奶粉封闭液按 1 ∶5 000 比例稀释配制孵育液，将 NC 膜完全浸入孵育液，放入 37 ℃摇床轻轻摇晃，孵育 1 h~1 .5 h。

用镊子压住 NC 膜倒弃孵育液，加入磷酸盐 Tween_20 缓冲液，将 NC 膜完全浸没，轻轻摇晃，洗膜3 min~5 min，用镊子压住 NC 膜倒弃洗液，重复洗膜 3 次。

6.4 二抗孵育

用镊子压住 NC 膜倒弃洗液，AP 标记的羊抗鼠 IgG 二抗和封闭液按 1 ∶5 000 比例稀释配制孵育液，将 NC 膜完全浸入二抗孵育液，放入 37 ℃摇床轻轻摇晃，孵育 1.5 h~2 h，再用镊子压住 NC 膜倒弃二抗孵育液。

加入磷酸盐 Tween_20 缓冲液，将 NC 膜完全浸没，轻轻摇晃，洗膜 3 min~5 min，用镊子压住 NC 膜倒弃洗液，重复洗膜 3 次。

6.5 显色

用镊子压住 NC 膜倒弃洗液，加入 BCIP/NBT 显色底物溶液，37 ℃ 静置显色 30 min;用水冲洗膜，室温晾干。

6.6 结果

显色后，首先观察对照的颜色反应，阳性对照应显紫色，阴性对照仍为水稻汁液的绿色或无色。然后观察样品的颜色反应，如果显紫色，则认定植株感染 SRBSDV;如为水稻汁液的绿色或无色，则认定植株未感染 SRBSDV。显色结果参见附录 B。

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7 白背飞虱检测

7.1 样品制备

采集白背飞虱高龄若虫或成虫，虫量不少于 100 头，装至塑料瓶中。样品储存方法同 6.1。

单头白背飞虱置于离心管中，加入 100 µL 碳酸盐包被液，捣烂白背飞虱，离心 3 min，取白背飞虱提取液备用。

7.2 点样

同 6.2。分别取 2 µL 白背飞虱阳性对照、阴性对照点于 NC 膜上。

7.3 一抗孵育

同 6.3。

7.4 二抗孵育

同 6.4。二抗用 HRP 标记的羊抗鼠 IgG。

7.5 显色

用镊子压住 NC 膜倒弃洗液，加入 TMB 显色底物，37 ℃ 静置显色 3 min~5 min;用水冲洗膜，室温晾干。

7.6 结果

7.6.1 白背飞虱带毒结果

显色后，首先观察对照的颜色反应，阳性对照应显蓝色，阴性对照应不显色。然后观察样品的颜色反应，如果显蓝色，则认定白背飞虱携带 SRBSDV;如果不显色，则认定白背飞虱不携带 SRBSDV。显色结果参见附录 B。

7.6.2 带毒率计算

按照式(1)计算白背飞虱带毒率，结果保留到小数点后一位。

Lc ……………………………( 1 )

式中：

Lc ——白背飞虱带毒率;

Nc ——带毒白背飞虱虫量;

Nt ——测定白背飞虱总虫量。

8 报告

检测完成后可出具完整的检测报告，报告中应包含植株或白背飞虱样本采集地点、采集日期、检测样本数量、阳性样本数量与阴性样本数量，显色结果拍照留存，检测白背飞虱样本还需计算出带毒率。

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附录 A

(资料性)

一步双重 RT⁃PCR 方法

疑似感染 SRBSDV 的水稻组织或人工饲喂感染 SRBSDV 的水稻植株后获得的白背飞虱群体提取总 RNA，采用 One Step RT_PCR Kit 进行 一步 双重 RT_PCR 检测(引自 王强 等，2012)。 一步 双重 RT_ PCR 反应总体积 20 µL，内含样品总 RNA 抽提物溶液 1 µL，S5_F1/S5_R2(5'_ttacaactggagaagcattaacacg_ 3'/5'_atgaggtattgcgtaactgagcc_3')和 S10_oF/S10_oR(5'_cgcgtcatctcaaactacag_3' /5'_tttgtcagcatctaaagcgc_3')终浓 度分 别为 240 nmol /L 和 120 nmol /L，其他 各组 分参 照试 剂盒 说明。 反应 程序 为 50 ℃ 反转 录30 min;94 ℃ 预变 性 3 min;94 ℃ 变性 30 s，53 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 50 s，35 个循 环 ;72 ℃ 延伸 10 min。反应结束后，取 5 µL 反应产物，经 2% 琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统中观察。2 对引物扩增产物分别为病毒基因组 S5 ORF1 3'区段和 S10 病毒外壳蛋白编码区，大小为 819 bp 和 682 bp(见图 A.1)。

标引符号和序号说明：

M ——DNA 分子量标准;

1 ——阳性样本;

2 ——阴性样本。

图 A.1 一步双重 RT⁃PCR 凝胶电泳结果图

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附录 B

斑点免疫检测方法显色图示

感染 SRBSDV 水稻植株样品检测结果呈现紫色的阳性斑点，健康水稻叶片粗提液呈现叶片绿色斑点或无色 [见图 B.1 a)]。

携带 SRBSDV 白背飞虱检测结果呈现蓝色的阳性斑点，不携带 SRBSDV 白背飞虱呈现无色 [见图B.1 b)]。

a) 水稻样品 b) 白背飞虱样品

图 B.1 免疫斑点法检测结果显色图

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参考 文献

[ 1 ] 王强，周国辉，张曙光 . 南方水稻黑条矮缩病毒一步双重 RT⁃PCR 检测技术及其应用[J] . 植物病理学报，2012，42(1)：84⁃87

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