GB/T 28715-2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法

　　ICS 65. 120 B 46

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28715—2012

　　饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定

　　分光光度法

　　Determination ofacidicand neutralproteaseactivityin feed additives—

　　Spetrophotometricmethod

　　2012-09-03发布 2013-02-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28715—2012

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归 口 。

　　本标准起草单位 :农业部农产品及转基因产品质量安全监督检验测试中心(杭州) 、浙江大学饲料科学研究所 、武汉新华扬生物有限公司 。

　　本标准主要起草人 :王小骊 、柳爱春 、邹晓庭 、吴琪 、赵芸 、朱加虹 、陈小丽 、周樱 、谢红云 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28715—2012

　　饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定

　　分光光度法

　　1 范围

　　本标准规定了饲料添加剂酸性和中性蛋白酶活力的测定方法 。

　　本标准适用于饲料添加剂酸性 、中性蛋白酶产品中酶活力的测定 , 以及复合酶产品中中性蛋白酶活力的测定 。

　　本标准定量限为 500 U/g(U/mL) 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　酸性、中性蛋白酶活力单位 acidicand neutralproteaseactiveunit

　　在一定温度(40 ℃ ±0. 2 ℃) 和 相 应 的 pH 条 件 下(酸 性 蛋 白 酶 pH3. 0, 中 性 蛋 白 酶 pH7. 2) , 在1 min 内水解酪蛋白产生相 当 于 1 μg酚 基 氨 基 酸(由 酪 氨 酸 等 同 物 表 示) 的 酶 量 , 为 1 个 酶 活 单 位 ,以 U表示 。

　　4 原理

　　蛋白酶在一定的温度和 pH 条件下 ,水解酪蛋白底物产生含有酚基的氨基酸(如 :酪氨酸 、色氨酸) ,在碱性条件下 ,可将福林试剂(Folin) 还原 ,生成钼蓝与钨蓝 ,其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比 。通过在 680 nm 测定其吸光度 ,得到酶解产生的酚基氨基酸的量 ,进而计算蛋白酶活力 。

　　5 试剂和材料

　　除非另有说明 ,在分析中使用的试剂均为分析纯 ,水均为符合 GB/T 6682规定的二级水 。

　　5. 1 碳酸钠溶液[c(Na2CO3 ) =0. 4 mol/L]

　　称取无水碳酸钠(Na2CO3 )42. 4 g,用水溶解并定容至 1 000 mL。

　　5. 2 三氯乙酸溶液[c(CCl3—COOH) =0. 4 mol/L]

　　称取三氯乙酸 65. 4 g,用水溶解并定容至 1 000 mL。

　　1

　　GB/T 28715—2012

　　5. 3 盐酸溶液[c(HCl) = 1 mol/L]

　　取浓盐酸 85 mL,加水稀释并定容至 1 000 mL, 即为 1 mol/L盐酸溶液 。

　　5. 4 盐酸溶液[c(HCl) =0. 1 mol/L]

　　取 100 mL 1 mol/L盐酸溶液(5. 3) ,定容至 1 000 mL, 即为 0. 1 mol/L盐酸溶液 。

　　5. 5 氢氧化钠溶液[c(NaOH) =0. 5 mol/L]

　　取氢氧化钠 20 g,加水稀释并定容至 1 000 mL, 即为 0. 5 mol/L氢氧化钠溶液 。

　　5. 6 福林(Folin)试剂

　　于 2 000 mL磨 口 回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4 · 2H2 O)100. 0 g、钼酸钠(Na2 MoO4 · 2H2 O) 25. 0 g、水 700 mL、85%磷酸 50 mL、浓盐酸 100 mL。小火沸腾回流 10 h,取下回流冷却器 ,在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4 )50 g,水 50 mL和数滴浓溴水(99%) ,再微沸 15 min, 以除去多余的溴(冷却后仍有绿色需再加溴水 ,再煮沸除去过量的溴) ,冷却后加水定容至 1 000 mL。 混匀 、过滤 。试剂应呈金黄色 ,贮存于棕色瓶内 。使用时 , 以 1份福林(Folin)试剂与 2份水混匀 ,制成稀福林(Folin)试剂 。

　　5. 7 乳酸缓冲液(pH3. 0,适用于酸性蛋白酶)

　　甲液 :称取 10. 6 g乳酸(85% ~ 90%) ,加水稀释并定容至 1 000 mL。

　　乙液 :称取 16g乳酸钠(70%) ,加水稀释并定容至 1 000 mL。

　　使用溶液 :取 4份甲液 ,加乙液(约 1份)调整 pH 至 3. 0±0. 05,此溶液在 4 ℃冰箱贮存 ,有效期为3 d。

　　5. 8 磷酸缓冲液(pH7. 2,适用于中性蛋白酶)

　　分别称取磷酸氢二钠(Na2 HPO4 )2. 34 g 和磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H2 O) 1. 00 g,用水溶解 , 用0. 1 mol/L盐酸溶液(5. 4)或 0. 5 mol/L氢 氧 化 钠 溶 液(5. 5) , 单 向 调 整 pH 至 7. 2±0. 05, 并 定 容 至1 000 mL, 备用 。

　　5. 9 1%酪蛋白溶液

　　5. 9. 1 1%酸性酪蛋白溶液(pH3. 0)

　　准确称取酪蛋白1) 1. 000 g,先用约 0. 5 mL浓乳酸湿润后 ,再加入乳酸缓冲液(5. 7)约 80 mL,在沸水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解 ,冷却后 ,用 0. 1 mol/L盐酸溶液(5. 4)或 0. 5 mol/L氢氧化钠溶液(5. 5) ,单向调整 pH 至 3. 0±0. 05,并转入 100 mL容量瓶中 ,用乳酸缓冲液(5. 7)定容至刻度 。此溶液在 4 ℃冰箱贮存 ,有效期为 3 d。

　　5. 9. 2 1%中性酪蛋白溶液(pH7. 2)

　　准确称取酪蛋白1) 1. 000 g,先用约 0. 5 mL氢氧化钠溶液(5. 5)湿润后 ,再加入磷酸缓冲液(5. 8)约80 mL,在沸水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解 ,冷却后 ,用 0. 1 mol/L盐酸溶液(5. 4)或 0. 5 mol/L氢氧化钠溶液(5. 5) ,单向调整 pH 至 7. 2±0. 05,并转入 100 mL容量瓶中 ,用磷酸缓冲液(5. 8)定容至刻度 。其余同 5. 9. 1。

　　1) 标准使用的酪蛋白由中国药品生物制品检定所提供 。 给出这一信息是为了给使用 者 提 供 一 个 相 对 标 准 ,如 果其他产品能有相同的效果 ,则可以使用等效产品 。

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　　GB/T 28715—2012

　　5. 10 L-酪氨酸标准物质

　　纯度 ≥95% 。

　　5. 11 L-酪氨酸标准储备溶液

　　精确称取预先于 105 ℃干燥至恒重的 L-酪氨酸标准物质 0. 100 0 g,用 20 mL 1 mol/L盐酸溶液(5. 3)溶解后 ,再用蒸馏水定容至 100 mL, 即为 1 mg/mL L-酪氨酸标准储备溶液 。

　　5. 12 L-酪氨酸标准溶液

　　临用前 ,准确吸取 10. 0 mL 1 mg/mL酪氨酸标准储备溶液(5. 11) ,用 0. 1 mol/L盐酸溶液(5. 4)定容至 100 mL, 即得到 100 μg/mL L-酪氨酸标准溶液 。

　　6 仪器与设备

　　除常用实验室仪器设备外 ,应有下述仪器设备 : 6. 1 分光光度计 :波长范围 350 nm~ 800 nm。

　　6. 2 pH计 :精度为 0. 01pH单位 。

　　6. 3 分析天平 :感量 0. 000 1 g 和 0. 01 g。

　　6. 4 恒温振荡水浴锅(或普通水浴锅) :精度为 ±0. 2 ℃ 。

　　6. 5 秒表或定时钟 。

　　7 分析步骤

　　7. 1 标准曲线绘制

　　分别准确吸取 100 μg/mL L-酪氨酸标准溶液 0. 00 mL、1. 00 mL、2. 00 mL、3. 00 mL、4. 00 mL、 5. 00 mL 和 6. 00mL于 10mL容量瓶中 ,用水定容至刻度 ,摇匀 ,制成每毫升分别含 L-酪氨酸 0. 0 μg、 10. 0 μg、20. 0 μg、30. 0 μg、40. 0 μg、50. 0 μg和 60. 0 μg的标准工作溶液 。

　　分别吸取 L-酪氨酸标准工作溶液 1. 0 mL,加 5. 0 mL碳酸钠溶液(5. 1)和 1. 0 mL稀福林(Folin)试剂(5. 6) ,于具塞试管中(每个浓度做 2个平行) ,混匀 。

　　将标准管同时置于 40℃水浴 ,反应 20min,取出 ,置于冷水中 ,迅速冷却至室温 ,用 10 mm 比色皿 ,以空白管调仪器零点 ,在分光光度计波长 680 nm 处测吸光度 。 以 L-酪氨酸含量为横坐标 , 以吸光度为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,获得线性回归方程 。 回归系数(r2 )在 0. 9978 以上时 ,方可使用 ,否则应重做 。

　　新配制的福林(Folin)试剂应制作新的标准曲线 。

　　7. 2 试样制备

　　7. 2. 1 液体酶试样的制备

　　根据样品酶活力大小 , 吸取适量的液体酶液 ,酸性蛋白酶试样用乳酸缓冲液(5. 7)[中性蛋白酶试样则用磷酸缓冲液(5. 8)]稀释至酶活力约为 5 U/mL~ 20 U/mL,待测 。

　　7. 2. 2 固体酶试样的制备

　　将试样粉碎或充分碾碎 ,过孔径为 0. 25 mm 筛 。根据样品酶活大小 ,称取 0. 2 g~ 2 g样品,精确至

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　　GB/T 28715—2012

　　0. 001 g,置于 250 mL锥形瓶中 ,酸性蛋白酶试样准确加入 100 mL乳酸缓冲液(5. 7)[中性蛋白酶试样则加入磷酸缓冲液(5. 8)] ,搅拌使试样充分混匀 ,30 ℃ 100 r/min振荡水浴(或用普通水浴锅 ,每 5 min搅拌 1 次) ,水浴提取 30 min,摇匀 ,用中速定性滤纸过滤 。滤液用乳酸缓冲液(5. 7)[中性蛋白酶试样则用磷酸缓冲液(5. 8)] ,稀释至酶活力约为 5 U/mL~ 20 U/mL,推荐的样品第二次稀释倍数见表 1。

　　表 1 推荐样品第二次稀释的倍数

　　样品酶活/(U/mL或 U/g)

　　≤5 000

　　5 000~ 50 000

　　50 000~ 100 000

　　≥100 000

　　稀释倍数

　　1

　　10

　　20

　　50

　　7. 3 测定步骤

　　取三支 10 mL具塞试管(一支样品空白管 ,两支样品管) ,分别向三支试管中准确加入稀释好的待测酶液各 1. 0 mL,将试管放入 40 ℃ ±0. 2 ℃水浴中预热 5 min, 向两支样品管中加入 1. 0 mL经同样预热的 1%酪蛋白溶液(5. 9) ,准确计时反应 10 min,迅速 、准确地向三支试管中加入 2 mL 0. 4 mol/L三氯乙酸溶液(5. 2) , 于样品空白管中加入 1. 0 mL 1%酪蛋白溶液(5. 9) , 摇匀 。将三支试 管 继 续 置40 ℃ ±0. 2 ℃ 水浴中放置 10 min,取出 ,迅速冷却至室温 ,并用中速定性滤纸过滤 。

　　另取三支 10mL具塞试管(一支样品空白管 ,两支样品管) ,分别吸取上述相应的滤出液 1. 0 mL加入三支试管中 ,各加入 5. 0 mL 0. 4 mol/L碳酸钠溶液(5. 1) 、1. 0 mL稀福林(Foiln) 试剂(5. 6) ,摇匀 ,水浴 40 ℃ ±0. 2 ℃中放置 20 min,取出置于冷水中 ,迅速冷却至室温 。

　　用水代替滤液做试剂空白 , 以试剂空白管调仪器零点 ,在分光光度计波长 680 nm 下 ,用 10 mm 比色皿 ,分别测定样品空白管和样品管中样液的吸光度 ,将样品管与样品空白管吸光度之差取平均值 ,通过线性回归方程求出生成的酪氨酸的浓度 。

　　8 结果计算与表示

　　8. 1 结果计算

　　样品中酸性或中性蛋白酶活力以 Xi 表示 ,按式(1)计算 :

　　Xi …………………………( 1 )

　　式中 :

　　Xi — 蛋白酶活力 ,单位为酶活单位每克(U/g)或酶活单位每毫升(U/mL) ;

　　c — 样品管的酪氨酸浓度 ,单位为微克每毫升(μg/mL) ;

　　c0 — 样品空白管的酪氨酸浓度 ,单位为微克每毫升(μg/mL) ;

　　V — 固体酶试样提取液的总体积或液体酶试样第一次稀释总体积 ,单位为毫升(mL) ;

　　N — 样品提取液第二次稀释的倍数 ;

　　4 — 酶反应体系总体积 ,单位为毫升(mL) ;

　　1. 0— 参与反应的酶量 ,单位为毫升(mL) ;

　　m — 试样质量或体积 ,单位为克(g)或毫升(mL) ;

　　10 — 反应时间 ,单位为分钟(min) 。

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　　GB/T 28715—2012

　　8. 2 结果表示

　　以平行样的平均值为最终的酶活力测定值 ,计算结果保留整数位 。

　　9 重复性

　　试样应至少取两份平行样进行重复测定 ,平行样的相对标准偏差不超过 10. 0% 。

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