GB/T 28642-2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应（PCR）法

　　ICS 65. 120 B 46

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28642—2012

　　饲料中沙门氏菌的快速检测方法

　　聚合酶链式反应(PCR) 法

　　Rapiddetermination ofSalmonella spp. in animalfeedingstuffs—

　　PCR method

　　2012-07-31发布 2012-11-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28642—2012

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归 口 。

　　本标准起草单位 :农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心(沈阳) 。

　　本标准主要起草人 :张秀芹 、张建勋 、杜柏林 、李欣南 、杨希国 、马俊驰 、陈晓月 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28642—2012

　　饲料中沙门氏菌的快速检测方法

　　聚合酶链式反应(PCR)法

　　1 范围

　　本标准规定了饲料中沙门氏菌的快速检测的 PCR方法 。

　　本标准适用于饲料中沙门氏菌的定性筛选 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检测方法

　　GB/T 14699. 1 饲料 采样

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　SN/T 1193 基因检验实验室技术要求

　　SN/T 1870 食品中致病菌检测方法 实时 PCR法

　　3 原理

　　利用沸水浴使菌体细胞破裂 ,释放基因组 DNA,离心使细胞壁等有形物沉淀 , 以上清液为模板进行扩增 ,琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产物 。

　　4 试剂和材料

　　除另有规定外 ,试剂为分析纯或生化试剂 ,试验用水符合 GB/T 6682的要求 。

　　4. 1 沙门氏菌检测用引物(对)序列为 :

　　SalF:5′-TCG CAC CGT CAA AGG AACCGT AAA GC-3′

　　SalR:5′-GCA TTA TCG ATC AGT ACCAGCCGT CT-3′

　　4. 2 Premix Taq 缓 冲 液 (2× ) : 内 含 Taq DNA 聚 合 酶 1. 25 U/25 μL, 4 mmol Mg2+ , dNTP各0. 4 mmol。

　　4. 3 琼脂糖 : 电泳级 。

　　4. 4 Marker2000。

　　4. 5 缓冲蛋白胨水(BPW) :见 A. 1。

　　4. 6 大豆蛋白胨肉汤(RVS) :见 A. 2。

　　4. 7 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC) :见 A. 3。

　　4. 8 10倍上样缓冲液(10×loading buffer) :0. 05%的溴酚蓝 ,50%丙三醇溶液 ,1%的 SDS。

　　4. 9 质控菌株 :沙门氏菌阳性标准菌株 。

　　4. 10 50×TAE缓冲液 :见 A. 4。

　　1

　　GB/T 28642—2012

　　4. 11 1×TAE缓冲液 :见 A. 5。

　　4. 12 溴化乙锭(5mg/mL) :见 A. 6。

　　注 : 4. 2 和 4. 8缓冲液为商品化成品 。 以上用于 PCR反应及电泳试验的试剂可用功能相当的其他产品替代 。

　　5 仪器设备

　　5. 1 PCR仪 。

　　5. 2 恒温水浴锅 。

　　5. 3 离心机 :离心转速 12 000g。

　　5. 4 微量移液器 。

　　5. 5 电泳仪 。

　　5. 6 凝胶成像仪 。

　　5. 7 天平 :感量 0. 01 g。

　　5. 8 电热恒温培养箱 。

　　6 试样选取与制备

　　按照 GB/T 14699. 1采样 ,将实验室样品充分混匀后密封低温保存待用 ,注意整个过程中不要将样品人为污染 。

　　7 检验步骤

　　7. 1 样品的增菌及模板的制备

　　取 25g样品于 225mL 的缓冲蛋白胨水(BPW ,4. 5)中 ,37℃ ±1℃培养 18h±2h进行预增菌 ,取0. 1 mL预增菌液转移至 10 mL大豆蛋白胨肉汤(RVS,4. 6)培养基内 ,41. 5 ℃ ±1 ℃培养 24 h±3 h。同 时取 10mL预增菌液于 100mL 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC,4. 7)中 37℃ ±1℃培养 24h±3h,进行选择性增菌 ,取选择性增菌液 1 mL于离心管中 10000g离心 10min,弃上清 ,1 mL无菌去离子水悬浮离心 10 min,弃上清 ,再用 0. 2 mL无菌去离子水悬浮 ,95 ℃水浴 20 min,将离心管迅速转移至冰浴中使其迅速冷却 ,用涡旋仪混匀裂解物 ,20 ℃ ~ 25 ℃下 10000g离心 3 min,转移上清至新鲜管中备用(模板制备可选用商业试剂盒) 。检测过程中分别设阳性对照和阴性对照 ,用添加沙门氏菌阳性标准菌株的样品作阳性对照 ,用不含沙门氏菌的样品作阴性对照 。

　　7. 2 PCR扩增

　　50 μL的反应体系 , 在 0. 2 mL 的 反 应 管 中 , Premix Taq缓 冲 液(4. 2) 25 μL, 模 板 4 μL, 浓 度 为20 μmol/L的上下游引物各 1 μL,去离子水 19μL。

　　反应程序为 :94 ℃预变性 2 min, 30个循环 : 94 ℃变性 1 min, 58. 4 ℃退火 40 s, 72 ℃延伸 30 s; 72 ℃终延伸 7 min后 4 ℃保存 。

　　7. 3 电泳检测 PCR扩增产物

　　取 1. 5 g琼脂糖(4. 3) ,于 100 mL 1×TAE缓冲液(4. 11)中加热,充分熔化 ,冷至 65℃左右的时候 ,加入 10 μL溴化乙锭(4. 12) ,充分混匀 , 根据需要在模板内放入合适的梳子 , 制成约 5 mm 厚的胶块 。在电泳槽中加入 1×TAE缓冲液 ,使液面没过凝胶 2 mm~ 3 mm。将 6 μL~8 μL的 PCR 扩增产物与 1 μL 10倍上样缓冲液(4. 8)混合后点样 ,取 6 μL Marker 2000 (4. 4)点样 。 5 V/cm~ 8 V/cm 恒压电泳 ,直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 ,用成像仪进行凝胶成像 。

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　　GB/T 28642—2012

　　8 结果表述

　　在阴性对照于 330 bp处未出现条带 ,而阳性对照在 330 bp处出现扩增条带的条件下 ,如待测样品在 330 bp处未出现相应大小的扩增条带 ,则可报告待测样品未检出沙门氏菌 ; 如待测样品在相应处出现扩增条带 ,则为疑似阳性样品,此时需用 GB/T 13091进行确证 ,最终结果以后者检测结果为准 。对于疑似阳性样品,可以对其扩增产物进行测序 ,结果参照附录 B。

　　如果阴性对照出现条带和(或)阳性对照未出现预期大小的扩增条带 ,本次待测样品的结果无效 ,应重新进行检测 ,并排除污染因素 。

　　9 检测过程中防止交叉污染的措施

　　按照 SN/T 1193、SN/T 1870和 GB 19489的要求执行 。

　　10 废弃物处理

　　检测过程中的废弃物及一切可能被污染的物品均应做无害化处理 。

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　　GB/T 28642—2012

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　培养基及缓冲液的配制

　　A. 1 缓冲蛋白胨水(BPW)

　　A. 1. 1 成分

　　蛋白胨 10. 0 g

　　氯化钠 5. 0 g

　　磷酸氢二钠 9. 0 g

　　磷酸二氢钾 1. 5 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　pH7. 0

　　A. 1. 2 制法

　　按上述成分分配好 ,校正 pH ,分装于大瓶中 , 121 ℃高压灭菌 20 min, 临用时分装在 500 mL无菌瓶中 ,每瓶 225 mL,或配好后校正 pH ,分装于 500 mL瓶中 ,每瓶 225 mL, 121 ℃高压灭菌 20 min,冷却备用 。

　　A. 2 大豆蛋白胨肉汤(RVS)

　　A. 2. 1 溶液 A

　　A. 2. 1. 1 成分

　　蛋白胨 5. 0 g

　　氯化钠 8. 0 g

　　磷酸二氢钾 1. 4 g

　　磷酸氢二钾 0. 2 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　pH7. 0

　　A. 2. 1. 2 制法

　　将各成分加入蒸馏水中 ,加热至约 70℃溶解 。此溶液需当天使用 。

　　A. 2. 2 溶液 B

　　A. 2. 2. 1 成分

　　氯化镁 400. 0 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　A. 2. 2. 2 制法

　　将氯化镁溶于水中 。

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　　GB/T 28642—2012

　　A. 2. 3 溶液 C

　　A. 2. 3. 1 成分

　　孔雀绿 0. 4 g

　　蒸馏水 100 mL

　　A. 2. 3. 2 制法

　　将孔雀绿溶于水中 。溶液可室温保存于棕色玻璃瓶中 。

　　A. 2. 4 完全培养基

　　A. 2. 4. 1

　　成分

　　溶液

　　A

　　1 000 mL

　　溶液

　　B

　　100 mL

　　溶液

　　C

　　10 mL

　　A. 2. 4. 2 制法

　　按上述比例配制 ,校正 pH , 使 灭 菌 后 pH 为 5. 2, 分 装 于 试 管 中 , 每 管 10 mL。 115 ℃高 压 灭 菌15 min。

　　冰箱保存 。

　　A. 3 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)

　　A. 3. 1 基础液

　　A. 3. 1. 1 成分

　　胰蛋白胨 5. 0 g

　　乳糖 4. 0 g

　　磷酸氢二钠 10. 0 g

　　亚硒酸钠 4. 0 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　pH7. 0

　　A. 3. 1. 2 制法

　　溶解前三种成分于水中,煮沸 5 min,冷却后 ,加入亚硒酸钠 ,校正 pH后分装 ,每瓶 1 000 mL。

　　A. 3. 2 L-胱氨酸溶液

　　A. 3. 2. 1 成分

　　L-胱氨酸 0. 1 g

　　1 mol/L氢氧化钠溶液 15 mL

　　A. 3. 2. 2 制法

　　在无菌环境中 ,用灭菌水将上述成分稀释到 100 mL,毋须蒸汽灭菌 。

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　　GB/T 28642—2012

　　A. 3. 3 完全培养基制备

　　基础液 1 000 mL

　　L-胱氨酸溶液 10 mL

　　pH7. 0

　　基础液冷却后 , 以无菌操作加 L-胱氨酸溶液 ,将培养基分装于适当容量的灭菌瓶中 ,每瓶 100 mL。注 : 培养基在配制当 日使用 。

　　A. 4 50× TAE缓冲液

　　A. 4. 1 0. 5 mol/L EDTA (pH8. 0)

　　取二水乙二胺四乙酸二钠 186. 1 g,加入 800 mL蒸馏水充分搅拌 ,加 10 mol/L的氢氧化钠调解pH 至 8. 0,待完全溶解后 ,定容至 1 L。高压灭菌 。

　　A. 4. 2 制法

　　Tris碱 242. 0 g溶于 700mL 的水中 ,加入 0. 5 mol/LEDTA (pH8. 0) 100mL,冰乙酸 57. 1 mL,充分溶解 ,用水定容至 1 L。

　　A. 5 1× TAE缓冲液

　　取 20 mL 50× TAE, 加 水 定 容 至 1 000 mL。 Tris-乙 酸 终 浓 度 为 0. 04 mol/L, EDTA 终 浓 度为0. 001 mol/L。

　　A. 6 溴化乙锭(5mg/mL)

　　取溴化乙锭 0. 050 0 g溶于 10 mL水中 。

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　　GB/T 28642—2012

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　PCR产物测序结果

　　沙门氏菌阳性菌株 PCR产物测序结果(331bp)如下 :

　　TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGCTGGCTTTCTCTTTCCAGTACGCTT CGCCGTTCGCGCGCGGCATCCGCATCAATAATACCGGCCTTCAAATCGGC

　　ATCAATACTCATCTGTTTACCGGGCATACCATCCAGAGAAAATCGGGCCG CGACTTCCGCGACGCGTTCTGAACCTTTGGTAATAACGATAAACTGGACC ACGGTGACAATAGAGAAGACAACAAAACCCACCGCCAGGCTATCGCCAAT AACGAATTGCCCGAACGTGGCGATAATTTCACCGGCATCAGCTTCAATCA AGATAAGACGGCTGGTACTGTCCGATAATGC